Braz J Med Biol Res, Mai 2004, Band 37(5) 625-634
Die Verwendung der reversen Transkriptions-PCR zur Diagnose von X-chromosomalen chronischen granulomatösen Erkrankungen
P. Agudelo-Flórez1, J.A. López1, J. Redher1, M.M.S. Carneiro-Sampaio2, B.T. Costa-Carvalho3, A.S. Grumach4 und A. Condino-Neto1
1Centro de Investigação em Pediatriaund die Abteilungen für Pädiatrie und Pharmakologie, Fakultät für Medizinische Wissenschaften, Staatliche Universität von Campinas, Campinas, SP, Brasilien
2Departamento für Immunologie, Institut für Biomedizinische Wissenschaften, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasilien.
3Disciplina für Allergie, Immunologie und Rheumatologie, Abteilung für Pädiatrie, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brasilien.
4Laboratório Medizinische Forschung 56, Abteilung für Dermatologie, Medizinische Fakultät,, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Zusammenfassung Einführung Patienten und Methoden Ergebnisse Diskussion Anerkennungen Korrespondenz und Fußnoten
Zusammenfassung 
Die chronische Granulomatose (CGD) ist eine Erbkrankheit des angeborenen Immunsystems, die durch einen defekten oxidativen Ausbruch von Phagozyten und eine anschließende Beeinträchtigung ihrer mikrobiziden Aktivität gekennzeichnet ist. Mutationen in einer der NADPH-Oxidase-Komponenten beeinflussen die Genexpression oder Funktion dieses Systems und führen zum Phänotyp der CGD. Defekte in gp91-phox führen zu X-chromosomaler CGD, die für etwa 70% der CGD-Fälle verantwortlich ist. Die Untersuchung des hoch heterogenen Genotyps von CGD-Patienten umfasst Mutationsanalysen, Northern-Blot- oder Western-Blot-Assays je nach Fall. Ziel der vorliegenden Studie war es, die reverse Transkription (RT) -PCR für die Analyse von molekularen Defekten, die für die X-chromosomale CGD bei acht brasilianischen Patienten verantwortlich sind, zu verwenden und ihr Potenzial für eine breitere Anwendung auf das molekulare Screening bei CGD zu bewerten. Die Gesamt-RNA wurde aus Epstein-B-Virus-transformierten B-Lymphozyten hergestellt und mit zufälligen Hexameren reverse transkribiert. Die resultierende cDNA wurde durch spezifische und überlappende Primerpaare PCR-amplifiziert, die drei Regionen des gp91-phox-Gens amplifizieren sollten: Exons 1-5, 3-9 und 7-13. Diese Strategie zeigte bei sieben Patienten eine defekte gp91-phox-Expression. Die RT-PCR-Ergebnisse stimmten in vier Fällen mit der klinischen Anamnese, biochemischen Daten (Nitroblue-Tetrazolium- oder Superoxid-Freisetzungstest) und verfügbaren Mutationsanalysen überein. In drei weiteren Fällen stimmten die RT-PCR-Ergebnisse mit der Anamnese und den biochemischen Daten überein. In einem anderen Fall war die RT-PCR trotz einer mit CGD kompatiblen Anamnese und defektem respiratorischem Burst normal. Wir schließen daraus, dass diese neue Anwendung der RT-PCR-Analyse – eine einfache, wirtschaftliche und schnelle Methode – für das Screening von molekularen Defekten bei 7 von 8 X-chromosomalen CGD-Patienten geeignet war.
Schlüsselwörter: Superoxid, Phagozyten, primäre Immunschwäche, Respiratorische Burst, Neutrophile, Human
Einleitung
Chronische granulomatöse Erkrankung (CGD) ist eine primäre Immunschwäche, die ursprünglich 1957 als klinische Einheit beschrieben wurde, die männliche Säuglinge betrifft und zu dieser Zeit als tödliche granulomatöse Erkrankung der Kindheit bezeichnet wurde. Die Hauptmerkmale von CGD sind wiederkehrende und schwere Infektionen, die die natürlichen Barrieren des Organismus wie die Atemwege und Lymphknoten und schließlich innere Strukturen wie Leber, Milz, Knochen und Gehirn betreffen (1-3). Die geschätzte Inzidenz dieser seltenen Krankheit beträgt 1/250.000 Lebendgeburten pro Jahr. Die Infektionen werden im Allgemeinen durch Katalase-negative Bakterien wie Staphylococcus aureus, gramnegative Bazillen und Pilzarten wie Aspergillus, Candida und Nocardia verursacht (4,5).
Das NADPH-Oxidase-System erzeugt Superoxid und andere reaktive Sauerstoffzwischenprodukte, die für die mikrobizide Aktivität von Phagozyten entscheidend sind. Der biochemische Defekt in CGD ist eine Beeinträchtigung der NADPH-Oxidase-Aktivität und die anschließende Unfähigkeit, Mikroorganismen zu zerstören (6). Die Hauptkomponenten des NADPH-Oxidase-Systems sind gp91-, p22-, p47-, p67- und p40-Phox. Molekulare Defekte, die CGD verursachen, sind im Allgemeinen auf Abwesenheit, geringe Expression oder Fehlfunktion einer der NADPH-Oxidasekomponenten zurückzuführen. Die X-chromosomale Form dieser Krankheit wird durch Defekte in gp91-phox, der schweren Kette von Cytochrom b588, verursacht und macht etwa 70% aller Fälle aus (7,8). Die autosomal-rezessiven Formen werden durch Defekte in einer der cytosolischen Komponenten der NADPH-Oxidase (p47- oder p67-Phox in 20 und 5% der Fälle) oder der Cytochrom-b588-Leichtkettenkomponente (p22-phox, 5% der Fälle) verursacht (9,10). CGD ist eine sehr heterogene Erkrankung: Über 300 Mutationen wurden in einer international gepflegten X-CGD-Datenbank registriert (8). Die Mutationen wurden weitgehend innerhalb der 13 Exons oder an den Exon / Intron-Grenzen des gp91-phox (CYBB) -Gens verteilt und fast 200 dieser Mutationen sind einzigartig.
Die Diagnose einer CGD basiert im Allgemeinen auf den klinischen Merkmalen der Erkrankung sowie einer defekten NADPH-Oxidase-Aktivität, wie sie durch abnormale Nitroblue-Tetrazolium (NBT) -, Dihydrorhodamin-123- oder Superoxidfreisetzungstests nachgewiesen wurde (11,12). Im stimulierten NBT-Test zeigen normale Personen fast 100% positive Zellen, während bei CGD-Patienten weniger als 5% der Zellen positiv sind (13). Darüber hinaus sind Zellen von Patienten mit varianter CGD positiv, zeigen aber nur eine sehr geringe Aktivität (6). Der NBT-Test erkennt auch die Träger von X-chromosomaler CGD (Mütter und Schwestern). Eine definitive molekulare CGD-Diagnose wird bei Patienten mit einem abnormalen NBT-Test oder einer abnormalen respiratorischen Burst-Aktivität gestellt, die eines der folgenden Merkmale aufweisen: eine Mutation in gp91-, p22-, p47- oder p67-Phox; fehlende mRNA für eines dieser Gene, die durch Northern-Blot-Analyse nachgewiesen wurden; und / oder fehlendes Protein für eine dieser Oxidasekomponenten durch Western Blot. Eine genetische, aber nicht molekulare Diagnose kann durch Nachweis von Cousins, Onkeln oder Neffen mütterlicherseits mit einem abnormalen NBT-Test oder Atemstoß festgestellt werden (14). Die Etablierung einer definitiven Diagnose dieser seltenen und hoch heterogenen Krankheit erfordert daher komplexe und teure Methoden wie eine Kombination aus Northern Blot oder Western Blot und Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse (SSCP), gefolgt von DNA-Sequenzierung mehrerer Familienmitglieder, die alle in hochkomplexen Forschungslabors durchgeführt werden.
Die reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) Methode beinhaltet die Amplifikation von cDNA durch PCR. Diese Technik kann in weniger anspruchsvollen Labors leicht standardisiert werden. Es liefert Informationen über die Genexpression und vorläufige Daten über die Struktur oder Größe der mRNA der defekten Komponente. RT-PCR wurde in der CGD-Forschung selten eingesetzt und beschränkt sich auf pathophysiologische Studien (15-29). Bisher wurde die mögliche Verwendung dieses nützlichen Tools zur endgültigen Diagnose der X-chromosomalen CGD, der häufigsten Form, nicht umfassend untersucht. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Verwendung von RT-PCR zum Screening von molekularen Defekten, die für X-chromosomale CGD, eine seltene und möglicherweise falsch diagnostizierte Immunschwäche, bei acht brasilianischen Patienten verantwortlich sind, zu bewerten.
Patienten und Methoden
Patienten
Die Studie umfasste 8 unabhängige männliche brasilianische Patienten mit wahrscheinlicher X-chromosomaler CGD (2 Schwarze und 6 Kaukasier; Alter 2-8 Jahre; Höhe 88-108 cm; Gewicht 11-19 kg). Die Patienten zeigten klinische Vorgeschichte von rezidivierenden schweren Infektionen wie Lungenentzündung, Lymphadenitis, Leberabszess, Pyodermitis und Nebenwirkungen auf BCG-Immunisierung. Sie wurden zur biochemischen und molekulardiagnostischen Auswertung an unser Labor überwiesen. Die schriftliche Einverständniserklärung wurde von den Teilnehmern vor der Studie eingeholt. Die Ethikkommission der medizinischen Fakultät genehmigte das Protokoll gemäß dem Helsinki-Übereinkommen und der Resolution 196/96 des brasilianischen Gesundheitsministeriums.
Biochemische Diagnose von CGD
Die biochemische Diagnose von CGD wurde gemäß den Kriterien der Panamerikanischen Gruppe für Immundefekte festgelegt. Eine Beeinträchtigung der NADPH-Oxidase-Aktivität wurde durch den NBT-Objektträgertest und / oder den Superoxid-Anionenfreisetzungstest durch periphere Blutneutrophile und mononukleäre Leukozyten nachgewiesen (14,30,31). Neutrophile und mononukleäre Leukozyten wurden durch Zentrifugation von Blutproben über einen Ficoll-Hypaken Dichtegradienten erhalten (32).
Der NBT-Objektträgertest basierte auf der Reduktion von NBT zu Formazan durch aktivierte Leukozyten (31). Der Assay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (30). Mehr als 95% von 200 normalen Neutrophilen, die mit 30 nM Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) stimuliert wurden, sollten in der Lage sein, NBT zu reduzieren. Fehlende Reaktion oder < 5% positive Zellen wurden als Hinweis auf eine Diagnose von CGD angesehen (14).
Die quantitative Superoxidfreisetzung durch Neutrophile und mononukleäre Leukozyten wurde durch einen modifizierten superoxiddismutasehemmenden Cytochrom-c-Reduktionstest (33-35) beurteilt. Die Menge an freigesetztem Superoxid wurde unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 0,21 nM / cm für Cytochrom c berechnet. Die Ergebnisse werden als nmol-Superoxid angegeben, das von 106 Zellen pro Stunde freigesetzt wird. Patienten mit CGD zeigten weniger als 10% der Kontrollwerte.
Screening molekularer Defekte, die für X-verknüpfte CGD verantwortlich sind
B-Lymphozyten von X-verknüpften CGD-Patienten wurden in vitro mit dem Epstein-B-Virus (EBV) transformiert (15,16), um eine reichhaltige Quelle von Nukleinsäuren für molekulare Studien bereitzustellen. Die EBV-transformierten B-Zelllinien reproduzieren die biochemischen und molekularen Defekte von CGD-Patienten (15,16,36) und machen wiederholte Blutentnahmen überflüssig. Kurz gesagt, periphere Blutleukozyten von X-chromosomalen CGD-Patienten wurden mit Überständen aus B95-8, einer EBV-produzierenden Zelllinie (15,16,36,37), in RPMI 1640-Medium, das mit hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (10%), 2 mm L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 µg / ml Streptomycin, bei 37ºC, in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2. Die Zelllebensfähigkeit wurde überwacht und die Kulturen wurden während des gesamten Untersuchungszeitraums beibehalten.
RNA-Proben aus EBV-transformierten B-Zelllinien wurden nach der Guanidin-HCl-Methode hergestellt, gefolgt von Ethanolfällung und Quantifizierung nach Standardmethoden (38,39). Die cDNA-Proben wurden durch reverse Transkription von 2 µg Gesamt-RNA mit hochgestellter II RT (GIBCO BRL) und zufälligen Hexameren erhalten (15). Die Qualität der mRNA-Proben wurde durch PCR-Amplifikation von ß-Actin, einer konstitutiven Genkontrolle (bp 920-943 und bp 1494-1471) (Genbank accession No. NM001101).
Die gp91-phox-Genexpression wurde mittels RT-PCR bestimmt. Spezifische und überlappende Primerpaare (Gen Bank accession No. NM_000397, Tabelle 1) wurden verwendet, um (30 Zyklen) drei exonische gp91-Phox-Regionen zu amplifizieren: 1-5, 3-9 und 7-13. Diese Strategie ermöglichte es uns, alle gp91-phox-Exons zu screenen. PCR-Produkte wurden mittels 2%iger Agarosegelelektrophorese analysiert und mit Ethidiumbromid angefärbt.
Die relative gp91-phox Genexpression wurde mit der Image Master Software (Pharmacia-Biotech) analysiert. Das Densitometrieergebnis für Zielproben wurde durch das Densitometrieergebnis von ß-Aktin, einer konstitutiven Genkontrolle, geteilt, wodurch der für die Analyse in Betracht gezogene Spiegel normalisiert wurde. Die Ergebnisse der RT-PCR-Assays wurden mit der Krankengeschichte des Patienten, biochemischen Assays (NBT- und / oder Superoxidfreisetzungstest) und verfügbaren Mutationsanalysedaten (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/) verglichen.htm).
Ergebnisse
Wir untersuchten 8 männliche Patienten mit klinischer Vorgeschichte rezidivierender schwerer Infektionen, die zur biochemischen und molekularen Diagnose von CGD an unser Labor überwiesen wurden. Die Ergebnisse der NBT-Objektträgertests und der Superoxidfreisetzungstests sind in Tabelle 2 dargestellt. Sechs der Patienten wiesen im NBT-Objektträgertest weniger als 5% positive Leukozyten auf. Sechs Patienten zeigten eine beeinträchtigte Superoxidfreisetzung durch Granulozyten und / oder mononukleäre Leukozyten (weniger als 10% im Vergleich zu gesunden Kontrollen). Vier Patienten hatten in beiden Tests abnormale Ergebnisse. Alle Patienten präsentierten mindestens einen abnormalen Test und erhielten die Diagnose einer wahrscheinlichen X-chromosomalen CGD. Die Mutter und die Schwester des Patienten T.B.P. präsentierten einen NBT-Objektträgertest, der mit dem Trägerstatus der X-chromosomalen CGD kompatibel war. Während des Studienzeitraums starb ein Patient (G.M.) an Lungenentzündung.
Als nächstes untersuchten wir die definitive Diagnose von X-chromosomaler CGD durch RT-PCR-Analyse der gp91-phox-Genexpression. Die Ergebnisse der RT-PCR-Amplifikation mit drei Sätzen überlappender Primer sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Qualität der mRNA-Probe wurde durch PCR-Amplifikation von ß-Aktin, einer konstitutiven Genkontrolle, überprüft. In diesem Fall wurden die erwarteten Normalprodukte erhalten (Abbildungen 1, 2 und 3).
In vier Fällen war es möglich, RT-PCR-Daten mit verfügbaren Mutationsanalysen abzugleichen, die an anderer Stelle von Patiño et al. (30) oder von unserer Gruppe ( //www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm ): J.E.M. präsentierte einen C469®T-Übergang in Exon 5, der eine Nonsense-Mutation (R157X) vorhersagte. M.F. präsentierte eine Nonsense-Substitution in Exon 3, R (Arginin) 73-Stop. R.S. zeigte eine 264 G®A Substitution an der 3′ Spleißstelle von gp91-phox Exon 3. Die cDNA-Sequenz zeigte eine Deletion von gp91-phox Exon 3, was zu einer instabilen oder nicht funktionellen Mutante gp91-phox führte. G.G. präsentierte ein defektes Spleißen von gp91-phox Exon 3 (die zugrunde liegende Mutation wurde noch nicht bestimmt). Die anderen Patienten werden weiterhin untersucht.
Insgesamt ermöglichte diese Strategie den Nachweis einer defekten gp91-phox-Expression bei sieben von acht Patienten. Die RT-PCR-Ergebnisse stimmten in vier Fällen mit der klinischen Anamnese, biochemischen Daten (NBT- oder Superoxidfreisetzungstest) und verfügbaren Mutationsanalysen überein. In drei weiteren Fällen stimmten die RT-PCR-Ergebnisse mit der Anamnese und den biochemischen Daten überein. In einem anderen Fall war die RT-PCR trotz einer mit CGD kompatiblen Krankengeschichte normal, ein defekter Atemstoß, der durch den NBT-Test und den Superoxidfreisetzungstest sowie NBT-Tests seiner Mutter und Schwester gekennzeichnet war, die mit dem X-chromosomalen CGD-Trägerstatus kompatibel waren.
Diskussion
Dieses Papier berichtet über die biochemischen und Genexpressionsstudien von 8 unabhängigen brasilianischen männlichen Patienten mit einer klinischen Vorgeschichte von CGD, die zur detaillierten Untersuchung an unser Labor überwiesen wurden. CGD ist eine seltene Erbkrankheit, bei der Phagozytenzellen kein Superoxidanion und andere reaktive Sauerstoffzwischenprodukte erzeugen können. Wir stellten zunächst die Diagnose einer wahrscheinlichen X-chromosomalen CGD mittels biochemischer Methoden wie den NBT-Objektträgertests und / oder Superoxid-Anionenfreisetzungstests auf. Unsere Ergebnisse zeigten, dass alle Patienten eine beeinträchtigte NADPH-Oxidase-Funktion und damit eine wahrscheinliche X-chromosomale CGD aufwiesen.
Beide Methoden tragen auf unterschiedliche Weise zur wahrscheinlichen Diagnose von CGD bei. Der NBT-Objektträgertest liefert Informationen über die Anzahl der Zellen, die NBT im Zytoplasma zu Formazan reduzieren, und die Intensität dieser Reduktion. So zeigen Patienten mit varianten Formen der X-chromosomalen CGD abnormale NBT-Objektträgertests, bei denen die meisten Zellen NBT schwach zu Formazan reduzieren. Der NBT-Objektträgertest erkennt auch weibliche Träger von X-chromosomaler CGD. Der Superoxid-Freisetzungstest misst die Reduktion von Cytochrom c durch Superoxid, das von aktivierten Leukozyten produziert wird, die in der Reaktion vorhanden sind, und ermöglicht die Diagnose varianter Formen von X-chromosomaler CGD. Beide Tests können in Labors mit geringer Komplexität leicht standardisiert werden und erfordern keine teure Ausrüstung. Der dihydrorhodamine 123 Test ist eine in hohem Grade empfindliche Methode für die biochemische Diagnose von CGD; jedoch erfordert er ein Fluss cytometer, ein sehr teures Instrument.
Wir untersuchten die gp91-phox-Genexpression in EBV-transformierten B-Lymphozyten von CGD-Patienten durch RT-PCR-Analyse. Spezifische und überlappende Primerpaare wurden verwendet, um drei Regionen des gp91-phox-Gens durch RT-PCR zu amplifizieren: Exons 1-5, 3-9 und 7-13. Diese Strategie ermöglichte den Nachweis einer defekten gp91-phox-Expression bei 7 von 8 Patienten. Die RT-PCR-Ergebnisse stimmten in vier Fällen mit der klinischen Anamnese, biochemischen Daten (NBT- oder Superoxidfreisetzungstest) und verfügbaren Mutationsanalysen überein. In drei weiteren Fällen stimmten die RT-PCR-Ergebnisse mit der Anamnese und den biochemischen Daten überein.
Die gp91-phox-Genexpression war in allen exonischen Regionen des Patienten R.B. reduziert Diese Reduktion kann das Ergebnis von Mutationen sein, die zu einer geringen RNA-Stabilität oder einer veränderten Transkriptionsaktivität führen. Patienten G.M. und T.P. zeigte fehlende Expression der Exons 7-13, was darauf hindeutet, dass die verminderte Expression dieser zusätzlichen 3′-End-Exons das Ergebnis einer RNA-Instabilität oder eines Spleißdefekts sein kann, z. B. teilweise korrektes Spleißen, um ein Signal zu erzeugen, aber teilweise abnormales Spleißen, um eine Primer-Bindungsstelle zu eliminieren, ein Thema, das durch zukünftige genomische DNA-Mutationsanalysen untersucht werden soll.
Patient G.G. präsentierte ein diffuses, geringes, kleineres Produkt der Exons 1-5 (Abbildung 1) und keine Expression anderer exonischer Regionen. Seine Mutationsanalyse zeigte einen Defekt an der Spleißstelle von Exon 3. In ähnlicher Weise ergab die Mutationsanalyse von Patient R.S. auch einen Defekt an der Exon 3-Spleißstelle. In diesem Fall konnte jedoch ein weniger häufiges PCR-Produkt nachgewiesen werden.
Patient M.F. zeigte eine verminderte Expression der exonischen Regionen 3-9 und 7-13, was das Ergebnis einer defekten Transkriptionsaktivität in Exon 3 sein kann. J.E.M. präsentierte eine Nonsense-Mutation in Exon 5, die zum Verlust der gp91-phox-Expression führte, wie durch RT-PCR-Analyse belegt, eine mögliche Folge der Nonsense-vermittelten mRNA-Instabilität.
In einem Fall, Patient T.P.B. Die gp91-phox-Genexpression war trotz einer mit CGD kompatiblen Familienanamnese und einer defekten respiratorischen Burst-Aktivität normal. In diesem Fall basierte die Diagnose einer wahrscheinlichen X-chromosomalen CGD auf abnormalen NBT-Tests bei seiner Mutter und seiner Schwester, die mit dem Trägerstatus kompatibel waren. Wir nehmen an, dass eine Punktmutation, wie z. B. eine einzelne Basenersetzung, die die PCR-Fragmentlänge oder -häufigkeit nicht ändert, in diesem speziellen Fall untersucht werden sollte.
RT-PCR ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Beurteilung der Genexpression. Diese Eigenschaft kann teilweise erklären, die Variabilität der gp91-phox-Genexpression bei den Patienten, die in dieser Studie, und die Bedeutung zu kombinieren, überlappende Paar von Primern zu screenen, die volle Länge der Nachricht. Die RT-PCR wurde in Einzelfallstudien als Teil der Erstdiagnose der verschiedenen Formen der CGD eingesetzt (17-22). RT-PCR-Analyse war auch nützlich bei der pränatalen Diagnose von CGD, resultierend aus p47-Phox-Mangel (23). Es wurde jedoch häufiger zur Untersuchung der Genregulation der NADPH-Oxidasekomponenten in einer Vielzahl von Zellen verwendet (15,16,24-29). Bisher wurde die mögliche Verwendung dieses nützlichen Tools zur endgültigen Diagnose der X-chromosomalen CGD, der häufigsten Form, nicht umfassend untersucht. Weitere Studien sollten durchgeführt werden, um die Empfindlichkeit und Spezifität dieses Tests im Vergleich zu anderen komplexen Assays wie Western- oder Northern-Blots zu vergleichen.
Insgesamt haben wir gezeigt, dass RT-PCR, eine einfache und kostengünstige Methode, die endgültige Diagnose von X-chromosomaler CGD in 7 von 8 Fällen etablierte, ohne dass komplexe und teure Methoden wie Northern Blot, Slot Blot, SSCP-Analyse oder genomische DNA-Sequenzierung verwendet werden müssen. Daher kann die RT-PCR ein geeignetes Instrument zur Diagnose von CGD in Labors in Entwicklungsländern sein. Es ist sehr wichtig, den endgültigen molekulargenetischen Defekt zu bestimmen, um die entsprechende genetische Beratung und Prognose für CGD-Verwandte bereitzustellen. Darüber hinaus werden molekulargenetische Untersuchungen des menschlichen NADPH-Oxidase-Systems das Wissen über diesen entscheidenden und uralten Abwehrmechanismus erweitern.
2. Landung BH & Shirkey HS (1957). Ein Syndrom der wiederkehrenden Infektion und Infiltration der Eingeweide durch pigmentierte Lipidhistiozyten. Pädiatrie, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey R & Stokstad ELR (1975). Wirkung von Selen bei der Verhinderung von exsudativer Diathese bei Küken. Proceedings der Gesellschaft für Experimentelle Biologie und Medizin, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Vorhand JR, Axtell RA, Roberts RL & Johnston Jr RB (1988). Klinische Merkmale und aktuelles Management chronischer granulomatöser Erkrankungen. Hämatologie / Onkologie Kliniken von Nordamerika, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993). Chronische granulomatöse Erkrankung: Die Lösung eines klinischen Rätsels auf molekularer Ebene. Klinische Immunologie und Immunpathologie, 67: S2-S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, Braun R, Jesaitis AJ & Parkos CA (1987). Das Glykoprotein, das durch den X-verknüpften chronischen granulomatösen Krankheitsort kodiert wird, ist eine Komponente des Neutrophilen Cytochrom-b-Komplexes. Natur, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi H, Volpp BD, Pearson DW, Nauseef WM & Curnutte JT (1989). Genetische Varianten der chronischen granulomatösen Erkrankung: Prävalenz von Mängeln von zwei cytosolischen Komponenten des NADPH-Oxidasesystems. New England Journal für Medizin, 321: 647-652.
10. Kreuz AR, Noack D, Rae J, Curnutte JT & Heyworth PG (2000). Hämatologisch wichtige Mutationen: die autosomal-rezessiven Formen der chronischen granulomatösen Erkrankung (erste Aktualisierung). Blutzellen, Moleküle und Krankheiten, 26: 561-565.
11. Schmied RM & Curnutte JT (1991). Molekulare Grundlage der chronischen granulomatösen Erkrankung. Blut, 77: 673-686.
12. Vokale SJ, Fleisher TA, Sekhsaria S, Alling DW, Maguire TE & Malech HL (1996). Genotypabhängige Variabilität in der durchflusszytometrischen Bewertung der reduzierten Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Oxidase-Funktion bei Patienten mit chronischer granulomatöser Erkrankung. Zeitschrift für Pädiatrie, 128: 104-107.
15. Condino-Neto EIN & Newburger PE (1998). NADPH-Oxidaseaktivität und Cytochrom-b558-Gehalt von humanen Epstein-Barr-Virus-transformierten B-Lymphozyten korrelieren mit der Expression von Genen, die Komponenten des Oxidasesystems kodieren. Archiv für Biochemie und Biophysik, 360: 158-164.
16. Condino-Neto A & Neuburger PE (2000). Interferon-Gamma verbessert die Spleißeffizienz von CYBB-Gentranskripten in einer Interferon-responsiven Variante der X-verknüpften chronischen granulomatösen Erkrankung aufgrund einer Spleißstellen-Konsensus-Region-Mutation. Blut, 95: 3548-3554.
19. Bonizzato A, Russo MP, Donini M & Dusi S (1997). Identifizierung einer Doppelmutation (D160V-K161E) im p67phox-Gen eines Patienten mit chronischer Granulomatose. Biochemische und biophysikalische Forschungskommunikation, 231: 861-863.
21. Noack D, Heyworth PG, Newburger PE & Kreuz AR (2001). Eine ungewöhnliche intronische Mutation im CYBB-Gen, die zu einer chronischen granulomatösen Erkrankung führt. Biochimica et Biophysica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler J, Curnutte JT, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock SJ & Görlach A (2000). Rekombinationsereignisse zwischen dem p47-phox-Gen und seinen hoch homologen Pseudogenen sind die Hauptursache für autosomal rezessive chronische granulomatöse Erkrankungen. Blut, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Pränataldiagnostik in zwei Familien mit autosomaler, p47 (phox) -defizienter chronischer granulomatöser Erkrankung aufgrund einer neuartigen Punktmutation in NCF1. Pränataldiagnostik, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff S & Bringas P (1999). Entwicklungsexpression von NADPH-Phagozytenoxidasekomponenten in Mausembryonen. Pädiatrische Forschung, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Schneide: Infektion durch das Mittel der menschlichen granulozytären Ehrlichiose verhindert die Atemwege platzen durch Herunterregulierung gp91phox. Zeitschrift für Immunologie, 164: 3946-3949.
26. Bayraktutan U, Blayney L & Shah AM (2000). Molekulare Charakterisierung und Lokalisierung der NAD(P)H-Oxidasekomponenten gp91-phox und p22-phox in Endothelzellen. Arteriosklerose, Thrombose und Gefäßbiologie, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese RM, Gallin JI & Lomax KJ (1992). Retrovirale Expression von rekombinantem p47phox-Protein durch Epstein-Barr-Virus-transformierte B-Lymphozyten von einem Patienten mit autosomaler chronischer granulomatöser Erkrankung. Blut, 79: 1829-1835.
28. Gorlach A, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M, Dehghani F & Busse R (2000). Ein gp91phox, das NADPH-Oxidase enthält, die selektiv in Endothelzellen exprimiert wird, ist eine Hauptquelle für die Erzeugung von Sauerstoffradikalen in der Arterienwand. Zirkulationsforschung, 87: 26-32.
29. Rouzaut A, Lopez-Moratalla N & de Miguel C (2000). Differentielle Genexpression bei der Aktivierung und Reifung menschlicher Monozyten. Archiv für Biochemie und Biophysik, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). Der NBT-Objektträgertest: eine einfache Screening-Methode zum Nachweis chronischer granulomatöser Erkrankungen und weiblicher Träger. Zeitschrift für Pädiatrie, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Isolierung von mononukleären Zellen und Granulozyten aus menschlichem Blut. Skandinavisches Journal für klinische und Laboruntersuchungen, 21 (Suppl 97): 1-77.
33. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1993). Neutrophile und mononukleäre Zellen von Patienten mit chronischer granulomatöser Erkrankung setzen Stickoxid frei. Britisches Journal für klinische Pharmakologie, 35: 485-490.
35. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1996). Die Wirkung der rekombinanten humanen Interferon-Gamma-Therapie auf die Stickoxidfreisetzung von Neutrophilen und einkernigen Zellen bei Patienten mit chronischer granulomatöser Erkrankung. Zeitschrift für Interferon- und Zytokinforschung, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin JI & Fauci ALS (1984). B-Zelllinien als Modelle für vererbte phagozytäre Erkrankungen: Superoxidbildung bei chronischen granulomatösen Erkrankungen und Granulate beim Chediak-Higashi-Syndrom. Zeitschrift für Immunologie, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Henle W & Henle G (1971). Die Etablierung lymphoblastoider Zelllinien aus adultem und fetalem humanem Lymphgewebe und seine Abhängigkeit von EBV. Internationale Zeitschrift für Krebs, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger PE & Weissman SM (1999). Eine modifizierte Methode zur Darstellung von 3′-Endobiton-Fragmenten von cDNAs: Molecular Profiling der Genexpression in Neutrophilen. Methoden in der Enzymologie, 303: 272-297.
Danksagung
Die Autoren danken den Patienten und ihren Familien für die Teilnahme und ihre Hilfe sowie der Krankenschwester Silvana Severino für die technische Unterstützung. Die Autoren danken auch Prof. Peter Newburger, University of Massachusetts Medical School, für eine kritische Überprüfung dieses Manuskripts.
Korrespondenz und Fußnoten