Alternatives Spleißen
Spleißosomen
Spleißen von Introns
Andere Spleißereignisse
Rekombinante DNA-Technologie
Anwendungen des Genspleißens
Ressourcen
Gene sind DNA-Sequenzen, die für Protein kodieren. Genspleißen ist eine Form der Gentechnik, bei der bestimmte Gene oder Gensequenzen in das Genom eines anderen Organismus eingefügt werden. Das Genspleißen kann sich auch spezifisch auf einen Schritt während der Verarbeitung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) beziehen, um diese für die Translation in Protein vorzubereiten.
Das Spleißen von Genen kann auch auf molekularbiologische Techniken angewendet werden, die darauf abzielen, verschiedene DNA-Sequenzen oder Gene in die DNA von Zellen zu integrieren. Einzelne Gene kodieren für spezifische Proteine, und basierend auf den Ergebnissen des Humangenomprojekts wird geschätzt, dass sich in jeder Zelle des menschlichen Körpers ungefähr 30.000 Gene befinden. Da die zellulären Funktionen in verschiedenen Geweben unterschiedliche Zwecke haben, werden die Gene einer komplexen konzertierten Anstrengung unterzogen, um das geeignete Niveau der Genexpression auf gewebespezifische Weise aufrechtzuerhalten. Zum Beispiel benötigen Muskelzellen spezifische Proteine, um zu funktionieren, und diese Proteine unterscheiden sich bemerkenswert von Proteinen in Gehirnzellen. Obwohl die genetische Information in beiden Zelltypen zum größten Teil gleich ist, führen die unterschiedlichen funktionellen Zwecke zu unterschiedlichen zellulären Bedürfnissen und daher werden in verschiedenen Gewebetypen unterschiedliche Proteine produziert.
Gene werden ohne die richtigen Signale nicht exprimiert. Viele Gene können inaktiv bleiben. Mit der entsprechenden Stimulation der Genexpression kann die Zelle verschiedene Proteine produzieren. Die DNA muss zuerst in eine Form verarbeitet werden, die andere Moleküle in der Zelle erkennen und in das entsprechende Protein übersetzen können. Bevor DNA in Protein umgewandelt werden kann, muss sie in Ribonukleinsäure (RNA) transkribiert werden. Bei der RNA-Reifung gibt es drei Schritte: Spleißen, Verschließen und Polyadenylieren. Jeder dieser Schritte ist an der Vorbereitung der neu erzeugten RNA beteiligt, die als RNA-Transkript bezeichnet wird, so dass sie den Kern verlassen kann, ohne abgebaut zu werden. In Bezug auf die Genexpression ist das Spleißen von RNA der Schritt, bei dem das Genspleißen in diesem Zusammenhang an bestimmten Stellen im gesamten Gen auftritt. Die Bereiche des Gens, die herausgespleißt werden, stellen nichtkodierende Regionen dar, die intervenierende Sequenzen sind, die auch als Introns bekannt sind. Die DNA, die in der verarbeiteten RNA verbleibt, wird als kodierende Regionen bezeichnet, und jede kodierende Region des Gens wird als Exon bezeichnet. Daher sind Introns intervenierende Sequenzen zwischen Exons, und das Spleißen von Genen beinhaltet die Exzision von Introns und das Zusammenfügen von Exons. Daher ist die endgültige Sequenz kürzer als die ursprüngliche kodierende Gen- oder DNA-Sequenz.
Um die Rolle des Spleißens bei der Expression von Genen zu verstehen, ist es wichtig zu verstehen, wie sich ein Gen in seine funktionelle Form verwandelt. Anfangs wird RNA Vorläufer-RNA (oder Prä-RNA) genannt. Prä-RNAs werden dann weiter zu anderen RNAs modifiziert, die als Transfer-RNA (tRNA), ribosomale RNA (rRNA) oder Boten-RNA (mRNA) bezeichnet werden. mRNAs kodieren Proteine in einem Prozess namens Translation, während die anderen RNAs wichtig sind, um der mRNA zu helfen, in Protein übersetzt zu werden. RNA-Spleißen erzeugt funktionelle RNA-Moleküle aus den Prä-RNAs.
Das Spleißen verläuft normalerweise in einer vorbestimmten Weise für jedes Gen. Experimente, die die Transkriptbildung in verschiedenen Zeitintervallen gestoppt haben, zeigen, dass das Spleißen einem Hauptweg folgt, der mit einem Intron beginnt und selektiv zu einem anderen, nicht unbedingt benachbarten Intron verläuft. Obwohl andere Wege verfolgt werden können, hat jedes Transkript seine eigene Primärsequenz für die Intronexzision.
Alternatives Spleißen
Ein einzelnes Gen kann verarbeitet werden, um zahlreiche Genprodukte oder Proteine zu erzeugen, und dieser Prozess wird als alternatives Spleißen bezeichnet. In diesem Fall verbleibt eine andere Kombination von Exons in der verarbeiteten RNA. Alternatives Genspleißen an verschiedenen Intron-Exon-Stellen innerhalb eines Gens kann verwendet werden, um mehrere Proteine aus demselben Prä-RNA-Molekül herzustellen. Proteine bestehen aus mehreren Domänen. Verschiedene Exons können für verschiedene Domänen kodieren. Selektives Spleißen kann sowohl unerwünschte Exons als auch Introns entfernen. Die Kombinationen von Proteinen, die aus alternativem Spleißen hergestellt werden können, sind in Struktur oder Funktion verwandt, aber nicht identisch. Durch die Verwendung eines einzelnen Gens zur Erzeugung mehrerer Proteine kann die DNA der Zelle effizienter genutzt werden.
Alternatives Spleißen kann gewebespezifisch sein, so dass verschiedene Proteine von zwei oder mehr verschiedenen Zelltypen aus demselben ursprünglichen Gen hergestellt werden. Oder ein Zelltyp kann mehrere Konfigurationen mit demselben Gen vornehmen. Zum Beispiel produziert eine Art Immunzelle, die B-Zelle genannt wird, Antikörper gegen zahlreiche Antigene. Antigene sind Fremdstoffe, die Immunantworten auslösen und Antikörper binden und Antigene, so dass sie abgebaut und entfernt werden können. Obwohl eine unendliche Anzahl von Antikörpern produziert werden kann, fallen alle Antikörper in einen von fünf grundlegenden Subtypen. Alternatives Spleißen wird verwendet, um diese fünf Antikörpertypen aus demselben Gen zu erzeugen.
Antikörper bestehen aus mehreren Immunoglobulin (Ig)-Molekülen. Diese Moleküle haben wiederum mehrere Domänen. Eine bestimmte Domäne, die als konstante Region der schweren Kette bezeichnet wird, unterscheidet die fünf Antikörpersubtypen IgM, IgD, IgG, IgE und IgA. Die verschiedenen Arten von Antikörpern erfüllen verschiedene Funktionen im Körper und wirken in verschiedenen Körpergeweben. Zum Beispiel werden IgAs in die Magen-Darm-Schleimhaut ausgeschieden und IgGs passiert die Plazenta. Das Gen, das diese schweren Kettenregionen kodiert, enthält Exons, die die Produktion einzelner Subtypen steuern, und das Gen wird abwechselnd gespleißt, um ein endgültiges mRNA-Transkript zu erhalten, das einen von ihnen herstellen kann.
Die meisten Gene liefern nur ein Transkript; Gene, die mehrere Transkripte liefern, haben jedoch zahlreiche zelluläre und Entwicklungsrollen. Alternatives Spleißen steuert die Geschlechtsbestimmung bei Drosophila melanogaster-Fliegen. Und eine Reihe von Proteinen werden in verschiedenen Zellen differentiell aus demselben Gen exprimiert. Verschiedene Muskelzellen verwenden alternatives Spleißen, um zellspezifische Myosin-Proteine zu erzeugen. Und embryonale Zellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien produzieren mehrere Formen des Proteins, Retinsäure. Einige Transkripte unterscheiden sich von verwandten Transkripten am 5′-Ende und andere können am 3′-Ende variieren.
Spleißosomen
Die Moleküle oder Molekülkomplexe, die tatsächlich RNA im Zellkern spleißen, werden Spleißosomen genannt. Spleißosomen bestehen aus kleinen Sequenzen von RNAs, die durch zusätzliche kleine Proteine gebunden sind. Dieser Spleißosomenkomplex erkennt bestimmte Nukleotidsequenzen an der Intron-Exon-Grenze. DNA und RNA werden im Allgemeinen beide in der 5′ bis 3′ Richtung gelesen. Diese Bezeichnung basiert auf den Phospho-Diester-Bindungen, die das Rückgrat von DNA- und RNA-Strängen bilden. Introns werden zuerst an ihrem 5′-Ende und dann an ihrem 3′-Ende geschnitten. Die beiden benachbarten Exons werden dann ohne das Intron miteinander verbunden. Das Spliceosom ist ein enzymatischer Komplex, der jeden dieser Schritte entlang der Prä-RNA ausführt, um Introns zu entfernen.
Die kleinen RNAs, aus denen das Spliceosom besteht, sind keine mRNAs, rRNAs oder tRNAs; Sie sind kleine nukleare RNAs (snRNAs). snRNAs sind in sehr geringen Konzentrationen im Zellkern vorhanden. Die snRNAs verbinden sich mit Proteinen, um kleine nukleare ribo-nukleare Proteinpartikel zu bilden. Mehrere snRNPs aggregieren zu einem Spliceosom. Diese Sekundärstruktur erkennt mehrere Schlüsselregionen im Intron und an der Intron-Exon-Grenze. Im Wesentlichen spielen snRNPs eine katalytische Spleißrolle. Das Fehlen einzelner snRNP-Komponenten kann das Spleißen hemmen. snRNPs sind nur einer von vielen Komplexen, die die Genexpression regulieren können.
Zusätzlich zu snRNPs verfügen einige Introns über automatische (Selbst-) Spleißfunktionen. Diese Introns werden Gruppe-II-Introns genannt. Introns der Gruppe II finden sich in einigen mitochondrialen Genen, die aus einem vom Zellkern getrennten Genom stammen und sich in kleinen Kompartimenten innerhalb der Zelle befinden, die als Mitochondrien bezeichnet werden. Mitochrondriafunktionen liefern Energie für den Energiebedarf der Zellen. Obwohl sich die gesamte chromosomale DNA im Zellkern befindet, befinden sich einige Gene in den Mitochondrien der Zellen. Introns der Gruppe II bilden Sekundärstrukturen unter Verwendung ihrer internen Intronregion in ähnlicher Weise wie Kernintrons. Diese mitochondrialen Introns leiten jedoch die Exon-Exon-Wiederverbindung selbst ohne snRNPs.
Spleißen von Introns
Verschiedene Spleißsignalsequenzen sind universell und werden innerhalb jeder gespleißten Intronstelle gefunden, während einige Signalsequenzen für einzelne Gene einzigartig sind. DNA besteht aus Basen, die als Nukleotide bezeichnet werden und das DNA-Alphabet darstellen. Es gibt vier Basen, Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und Cytosin (C). Die meisten Introns in höheren Lebensformen beginnen mit der Nukleotidsequenz G-T und enden mit der Sequenz A-G. Die Sequenzen definieren die „linken“ (5′) und „rechten“ (3′) Ränder des Introns und werden als konform mit der GT-AG-Regel beschrieben. Mutationen in einer dieser vier Positionen erzeugen Introns, die durch normale Spleißmechanismen nicht entfernt werden können. Innerhalb des Introns befindet sich eine weitere hochkonservierte Sequenz, die eine gewisse Variabilität in den Genen einer Spezies aufweist; Diese Region (als Verzweigungsstelle bezeichnet) ist der Bereich, der sich beim Schneiden mit dem 5′-Ende des Introns verbindet und sich dann zu einer Lariat-Form zusammenrollt. Dieses Lariat ist eine Schleife im Intron, die gebildet wird, wenn es aus der reifenden RNA entfernt wird.
Andere Spleißereignisse
Das Spleißen kann auch andere Moleküle als mRNA betreffen. tRNAs, die eine entscheidende Rolle bei der Ausrichtung von Aminosäuren entlang eines zu synthetisierenden Proteins spielen, können gespleißt werden. tRNAs werden nur von DNA codiert
SCHLÜSSELBEGRIFFE
Antikörper — Ein Molekül, das vom Immunsystem als Reaktion auf das Vorhandensein eines Antigens (einer Fremdsubstanz oder eines Partikels) erzeugt wird. Es markiert fremde Mikroorganismen im Körper zur Zerstörung durch andere Immunzellen.
Antigen — Ein Molekül, normalerweise ein Protein, das der Körper als fremd identifiziert und auf das er eine Immunantwort richtet.
Capping – Eine Modifikation am 5′-Ende eines reifen mRNA-Transkripts.
Zytoplasma — Das gesamte Protoplasma in einer lebenden Zelle, das sich außerhalb des Kerns befindet, im Unterschied zum Nukleoplasma, das das Protoplasma im Kern ist.
Desoxyribonukleinsäure (DNA) — Das genetische Material in einer Zelle.
Exons – Die Regionen der DNA, die für ein Protein kodieren oder tRNA oder mRNA bilden.
Gen -Eine diskrete Vererbungseinheit, dargestellt durch einen Teil der DNA, der sich auf einem Chromosom befindet. Das Gen ist ein Code für die Produktion einer bestimmten Art von Protein oder RNA-Molekül und damit für eine bestimmte vererbte Eigenschaft.
Genom – Der komplette Satz von Genen, die ein Organismus trägt.
Introns — nichtkodierende Sequenzen in einem Gen, die während der RNA-Verarbeitung gespleißt werden.
Mitochondrien — Intrazelluläre Organelle, die vom Zellkern getrennt ist, ein eigenes Genom hat und für die Energieerzeugung für verschiedene Gewebe wichtig ist.
Polyadenylierung – Eine Modifikation am 3′-Ende eines reifen mRNA-Transkripts.
Rekombinante DNA -DNA, die unter Verwendung spezifischer Enzyme geschnitten wird, so dass ein Gen oder eine DNA-Sequenz eingefügt werden kann.
Splicesome – Die intrazelluläre Maschinerie, die RNA verarbeitet, indem Introns aus der Sequenz entfernt werden.
wie alle anderen RNA-Moleküle. tRNAs haben jedoch eine einzigartige Struktur und Funktion, die sich von anderen RNA-Molekülen dadurch unterscheidet, dass sie dafür verantwortlich sind, die tatsächlichen Proteinbausteine (Aminosäuren) aus der codierten Nukleotidsequenz zusammenzubringen, um ein Protein oder Polypeptid aufzubauen. Da diese spezialisierten RNAs einzigartige Konformationen aufweisen, unterscheiden sich Enzyme, die Exons nach der Intronentfernung verbinden, von denen, die Introns in anderen RNA-Molekülen verbinden. Während Introns entfernt werden und Exons verbunden werden, sind die enzymatischen Moleküle nicht die gleichen wie die, die für die mRNA-Verarbeitung verwendet werden. Die Intronentfernung bei der tRNA-Verarbeitung ist im Vergleich zu anderen RNA-Introns weniger abhängig von internen Intronsequenzen.
Rekombinante DNA-Technologie
Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen, die das Spleißen von Genen beschreiben, haben dazu geführt, dass Wissenschaftler Nukleotidsequenzen schneiden und tempern können, die auch als rekombinante DNA-Technologie bezeichnet werden. Da Spleißen wörtlich das Verbinden separater Enden bedeutet, bezieht sich Genspleißen auf das Verbinden fast beliebiger Nukleotidsequenzen, um ein neues Genprodukt zu erzeugen oder eine neue Gensequenz einzuführen. Daher könnte fast jede genetische Sequenz in eine andere Sequenz gespleißt werden.
Bestimmte Enzyme, die Restriktionsenzyme genannt werden, werden in Laboratorien verwendet, um Nukleotide zu Sequenzen zu spleißen, zu verbinden (oder zu ligieren) und zu entfernen oder hinzuzufügen. Restriktionsenzyme werden in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet, um genetische Sequenzen aus und in andere Sequenzen zu entfernen und einzufügen. Diese Technologie hat es einigen Biotechnologie- und Pharmaunternehmen ermöglicht, große Mengen essentieller Proteine für medizinische und Forschungszwecke herzustellen. Beispielsweise kann ein Humaninsulinprotein in großem Umfang hergestellt werden, indem das Insulingen beispielsweise in das Genom von Bakterien eingefügt wird, um große Mengen des Proteins herzustellen. Wie ein Fotokopierer können solche Sequenzen viel Insulin für Diabetiker produzieren, die nicht in der Lage sind, selbst genug Insulin herzustellen. Diese Patienten können sich dann das gereinigte Insulin selbst injizieren, um ihre Krankheit zu behandeln.
Anwendungen des Genspleißens
Unter Verwendung der Genspleißtechnologie wurden Impfstoffe hergestellt. DNA aus einem Virus kann in das Genom eines harmlosen Bakterienstamm gespleißt werden. Wenn die Bakterien das virale Protein produzieren, kann dieses Protein geerntet werden. Da Bakterien schnell und einfach wachsen, kann eine große Menge dieses Proteins extrahiert, gereinigt und als Impfstoff verwendet werden. Es wird durch Injektion in ein Individuum eingeführt, was eine Immunantwort hervorruft. Wenn eine Person durch natürliche Exposition mit einem Virus infiziert wird, kann aufgrund der anfänglichen Impfung eine schnelle Immunantwort eingeleitet werden. Eine andere Anwendung der Gene-Spicing-Technologie hängt mit dem Gen zusammen, das an der Vitamin-B-Produktion beteiligt ist. Dieses Gen wurde aus einem Karottengenom entfernt und in das Genom von Reis gespleißt. Dies kann viele gesundheitliche Vorteile haben, insbesondere in Ländern der Dritten Welt, die auf Reis als Hauptnahrungsquelle angewiesen sind und keinen Zugang zu vitaminreichen Nahrungsquellen haben.
Die Gen-Spleißtechnologie ermöglicht es Forschern daher, neue Gene in das vorhandene genetische Material eines Genoms eines Organismus einzufügen, so dass ganze Merkmale, von der Krankheitsresistenz bis hin zu Vitaminen, von einem Organismus kopiert und übertragen werden können ein anderer.
Ressourcen
BÜCHER
Hall, Stephen und James Watson. Unsichtbare Grenzen: Der Wettlauf um die Synthese eines menschlichen Gens. Oxford: Oxford University Press, 2002.
Keller, Evelyn Fuchs. Das Jahrhundert des Gens. Boston: Harvard University Press, 2002.
Lambrecht, Bill. Abendessen im neuen Gene Cafe: Wie Gentechnik verändert, was wir essen, wie wir leben, und die globale Politik der Nahrung. New York: St. Martin’s Press, 2002.
Louise Dickerson