ELISA: Cómo Analizar Resultados Experimentales

Por Dr. Surat P, Ph. D. Revisado por Dr. Tomislav Meštrović, MD, Ph. D.

ELISA, o Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a enzimas, es una herramienta utilizada para detectar y cuantificar sustancias, como péptidos, proteínas, anticuerpos y hormonas. Implica la inmovilización de un antígeno o anticuerpo en una superficie, seguida de la adición de una muestra para ser analizada. La detección depende de una reacción específica antígeno-anticuerpo.

Jarun Ontakrai /

Qué hacer antes de ejecutar un ELISA

Siempre se debe realizar una prueba ELISA en réplicas (duplicados o triplicados) para lograr un número suficiente de muestras para calcular la desviación estándar y el coeficiente de variación. El coeficiente de error debe mantenerse por debajo del 20%. Si el error calculado es alto, se deben evaluar los errores que surjan debido al pipeteo, la contaminación de placas y reactivos, la evaporación y/o la temperatura.

Curva estándar

Se utiliza una curva estándar para medir la concentración de la muestra. En primer lugar, se representan los valores de absorbancia de las concentraciones estándar (pg/ml). También se realiza una curva negativa que no contiene ningún dato de muestra estándar y se utiliza para detectar y medir el ruido de fondo. Para una medición precisa, este valor de fondo debe restarse de la curva estándar.

Los valores de absorbancia de la concentración conocida pueden representarse como un control positivo. La concentración de la proteína diana se obtiene calculando primero la absorbancia media y luego utilizando la curva estándar para estimar la concentración.

También deben tenerse en cuenta los factores de dilución. Por ejemplo, si la muestra se ha diluido cuatro veces, la absorbancia debe multiplicarse por cuatro antes de utilizar la curva estándar para obtener la concentración.

Coeficiente de variación

La definición de coeficiente de variación es la relación entre la desviación estándar y la media, es decir, la desviación estándar (σ)/media (µ). Grandes valores de coeficiente de variación indican inexactitudes debidas al pipeteo o mezcla de reactivos entre pozos, contaminación bacteriana o fúngica, secado de pozos o variaciones de temperatura.

Recuperación de picos

El valor obtenido después de ejecutar la prueba ELISA depende de cómo interactúa una proteína dirigida con los anticuerpos, y esta interacción se compara con una curva de proteínas estándar. Varios factores, incluidos los anticuerpos tampón, matriz y heterofílicos, pueden afectar la unión de la muestra, por lo que esto debe tenerse en cuenta al determinar la precisión de un ELISA.

Se puede realizar un ensayo de espiga para determinar la precisión de los resultados de ELISA. En este ensayo, se añade o añade a la muestra una cantidad conocida de proteína recombinante. Luego, utilizando la curva estándar, se mide la cantidad de material. Grandes desviaciones en los valores medidos pueden indicar errores debidos a elementos desconocidos en el ensayo.

Ensayo de linealidad

El ensayo de linealidad también se utiliza para determinar la precisión de ELISA. En este caso, la «muestra enriquecida» se diluye en serie a 1:2, 1:4 y 1:8. Si se detecta la concentración de la muestra alterada, y si los resultados no muestran un cambio lineal en las mediciones, puede indicar errores en la precisión del ELISA.

En algunos casos, pueden observarse errores a determinadas concentraciones y dejar de observarse a concentraciones más bajas. En tales casos, puede ser necesario diluir la muestra antes de realizar las mediciones de concentración.

Solución de problemas

El ruido de fondo puede ser causado por una serie de factores, incluidos:

• Lavado insuficiente de los pozos
• Tampones de lavado contaminados
• Reactivo de detección excesivo
• Reactividad cruzada del anticuerpo
• Precipitación del tampón y/o del analito

A veces, se puede generar una curva estándar deficiente. Esto puede deberse a errores en la solución patrón, degradación de la norma, la norma se reconstituye incorrectamente o si la curva no se ajusta a la escala. Teniendo en cuenta lo último, el trazado se puede hacer utilizando diferentes escalas, como log-log o curva logística de 5 parámetros.

Lectura adicional

• Contenido del Ensayo de Inmunoabsorción Ligada a Enzimas (ELISA)
• Aplicaciones de ELISA
• Técnica de Western Blot – Lab Utilizada para Detectar Proteínas
• Aplicaciones de Anticuerpos
• Medición de Expresión Génica

Escrito por

Dr. Surat P

El Dr. Surat se graduó con un doctorado en Biología Celular y Mecanobiología del Instituto Tata de Investigación Fundamental (Mumbai, India) en 2016. Antes de su doctorado, Surat estudió para obtener una Licenciatura en Ciencias (B.Sc.) licenciada en Zoología, durante la cual recibió una Beca de Verano de la Academia de Ciencias de la India para estudiar las proteínas involucradas en el SIDa. Produce artículos de fondo sobre una amplia gama de temas, como ética médica, manipulación de datos, pseudociencia y superstición, educación y evolución humana. Es una apasionada de la comunicación científica y escribe artículos que cubren todas las áreas de las ciencias de la vida.

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