Estimulación Magnética Transcraneal Profunda: Diseño de Bobina Mejorado y Evaluación de los Campos Inducidos Utilizando el Modelo MIDA

Resumen

La estimulación de estructuras cerebrales profundas mediante estimulación magnética transcraneal (TMS) es un método para activar neuronas profundas en el cerebro y puede ser beneficioso para el tratamiento de trastornos psiquiátricos y neurológicos. Para investigar numéricamente la posibilidad de una estimulación cerebral más profunda (campos eléctricos que alcanzan el hipocampo, el núcleo accumbens y el cerebelo), se modelaron e investigaron bobinas TMS combinadas que usan la bobina de doble cono con la bobina de Halo (HDA). Se realizaron simulaciones numéricas utilizando MIDA: un nuevo modelo anatómico detallado basado en imágenes multimodales de la cabeza y el cuello humanos. Se calcularon las distribuciones 3D de densidad de flujo magnético y campo eléctrico. El porcentaje de volumen de cada tejido que está expuesto a una amplitud de campo eléctrico igual o superior al 50% de la amplitud máxima de E en la corteza para cada bobina se calculó para cuantificar la propagación del campo eléctrico (V50). Los resultados muestran que solo la bobina HDA puede propagar campos eléctricos al hipocampo, el núcleo accumbens y el cerebelo con V50 igual a 0,04%, 1,21% y 6,2%, respectivamente.

1. Introducción

La estimulación magnética transcraneal (TMS) es un método no invasivo e indoloro para activar neuronas en el cerebro y se puede utilizar como una sonda de funciones cerebrales superiores y una intervención para trastornos neurológicos y psiquiátricos . Se diseñaron varias bobinas para estimular diferentes regiones cerebrales para diferentes tratamientos (depresión y enfermedad de Parkinson), pero, debido a la atenuación rápida del campo eléctrico en las profundidades del cerebro, la EMT se ha restringido a objetivos corticales superficiales, de alrededor de 2-3 cm de profundidad . Sin embargo , estudios recientes muestran que el tratamiento para las depresiones también puede considerar áreas cerebrales no superficiales de 3-5 cm de profundidad, así como regiones más profundas de 6-8 cm de profundidad .

Utilizando TMS tradicionales, con bobinas circulares o en forma de ocho (Fo8), no se pueden alcanzar regiones del cerebro profundo, ya que el campo eléctrico disminuyó rápidamente en función de la profundidad del tejido para este tipo de bobinas . Por lo tanto, se necesitaban amplitudes de estimulación mucho más altas para estimular regiones neuronales más profundas. Sin embargo, tales intensidades altas en las fuentes pueden plantear muchas preocupaciones de seguridad y pueden causar molestias locales debido a la activación directa de nervios y músculos en el cuero cabelludo . Los diseños de bobinas adecuados para TMS profundos , como la bobina de doble cono , la bobina de Halo y la bobina en H, se desarrollaron para eludir estas limitaciones. La bobina de doble cono proporciona una penetración de campo más profunda y se ha utilizado para atacar la corteza cingulada anterior con la activación transsináptica . La bobina de Halo ha sido diseñada para aumentar el campo magnético a profundidad en el cerebro cuando se usa junto con las bobinas Fo8 y circulares existentes que se usan típicamente para TMS . El diseño de la bobina será una combinación de dos bobinas TMS utilizadas principalmente para aumentar la penetración profunda del campo eléctrico: la bobina de doble cono y la bobina de Halo. Los lugares de activación en el cerebro están relacionados con el área donde el campo eléctrico inducido es máximo. Estas ubicaciones, a su vez, dependen de la ubicación y la geometría de las bobinas, así como del modelo de cabezal para los estudios de simulación . A pesar de su importancia y del creciente uso clínico de las bobinas de TMS, el conocimiento de la distribución espacial del campo eléctrico inducido aún no se ha investigado exhaustivamente . Diferentes trabajos investigaron la distribución espacial del campo eléctrico inducido utilizando datos experimentales o métodos basados en simulaciones numéricas con modelos de cabeza simplificados como esferas (es decir,) o modelos de cabeza humana con muy pocos tejidos (es decir, ). Recientemente, Deng et al. se publicó un estudio exhaustivo utilizando un modelo de cabeza humana esférica para cuantificar la focalidad del campo eléctrico y la profundidad de penetración de varias bobinas TMS. Sin embargo, teniendo en cuenta la diferencia obvia y significativa entre la geometría del cerebro humano y la forma esférica, la distribución del campo eléctrico inducido será diferente en los dos modelos. Se entiende bien que la estructura del cerebro, la resolución y el número de tejidos pueden afectar la distribución del campo eléctrico y el campo eléctrico máximo en el cerebro, lo que puede resultar en la identificación incorrecta de los lugares de estimulación (es decir, mostró que la diferencia en el campo eléctrico puede ser mayor de 100 V/m entre modelos de cabeza humana jóvenes y adultos). En la geometría realista de la cabeza, y dado que la superficie de la cabeza no es uniforme y tiene una curvatura variable, la distribución del campo eléctrico resultante será mucho más sensible a la orientación y posición de la bobina . Guadagnin et al. recientemente se publicó un extenso estudio que proporciona una caracterización de las distribuciones inducidas de E en el cerebro de un modelo humano realista (Ella V1.3 de la población virtual que contiene 76 tejidos diferentes en todo el cuerpo) debido a varias configuraciones de bobinas. Recientemente, Iacono et al. desarrollaron un nuevo modelo anatómico multimodal del cuello y la cabeza humanos. . El nuevo modelo de alta resolución (hasta 500 µm) contiene 153 estructuras en la cabeza y el cuello y proporciona una caracterización detallada de los tejidos cerebrales profundos con una segmentación basada en atlas, lo que convierte al modelo MIDA en uno de los modelos basados en imágenes más avanzados para modelos anatómicos de última generación.

El objetivo de este trabajo es utilizar modelos numéricos para diseñar e investigar un diseño combinado de bobinas TMS profundas utilizando bobinas de doble cono y Halo. La investigación del efecto del modelo cerebral en el campo eléctrico inducido se realizó utilizando el modelo MIDA. La novedad de este artículo es la siguiente:(i)Modelar una bobina TMS profunda combinada que consiste en bobinas de Halo y doble cono para alcanzar estructuras cerebrales profundas (hipocampo, el núcleo accumbens y el cerebelo) y la caracterización del campo eléctrico inducido en el cerebro por la bobina combinada.(ii)Caracterización de los campos eléctricos inducidos utilizando MIDA: entre los modelos anatómicos basados en imágenes de última generación más detallados, incluida la validación de las simulaciones con resultados experimentales.

2. Materiales y Métodos

2.1. Plataforma de simulación

Las bobinas TMS y el modelo de cabeza humana se modelaron con un paquete de software comercial Sim4Life . Esta es una plataforma de simulación, que combina fantasmas humanos computables con solucionadores de física y modelos de tejidos. Sim4Life proporciona un sistema moderno y fácil de usar y contiene recursos de última generación para permitir una experiencia rápida y fácil al configurar geometrías de modelos. La densidad de flujo magnético y los campos eléctricos en la cabeza humana se analizaron con el solucionador magneto cuasistático Sim4Life, lo que permitió el modelado eficiente de regímenes EM cuasistáticos mediante la aplicación del método de elementos finitos en mallas de vóxeles graduadas. Las simulaciones numéricas se basan en la teoría de baja frecuencia de EM implementada en Sim4Life. Para un campo eléctrico E y un campo magnético B, asumiendo un potencial vectorial A con y un potencial eléctrico escalar, la ecuación de potencial escalar se refiere a la permitividad compleja definida como, es la conductividad eléctrica, es la permitividad eléctrica y es la frecuencia angular. Para una longitud característica y un valor de permeabilidad , la condición de aproximación cuasistática garantiza que la corriente óhmica solo perturbe de manera insignificante el campo B y que el potencial vectorial A sea equivalente al potencial vectorial magnetoestático . El potencial vectorial estático puede ser calculado por la ley Biot–Savart (cuando es constante en todo el dominio computacional). Dado que la mayoría de los materiales biológicos exhiben propiedades dieléctricas que obedecen en baja frecuencia, (1) se puede simplificar a la ecuación (2) que se implementa en el solucionador magneto cuasistático. Todas las condiciones de contorno se descuidan como condiciones de contorno de Neumann cero, es decir, flujo normal que desaparece. El solucionador de valor real es utilizado por este modelo. El campo eléctrico se calcula solo en el dominio con pérdida (), mientras que el campo H se calcula en todas partes. Por lo tanto, la cuadrícula predeterminada solo cubre el dominio con pérdida.

2.2. Modelos de bobinas numéricas

Recientemente se diseñaron nuevas bobinas TMS profundas utilizando bobinas combinadas. Por ejemplo, Lu y Ueno diseñaron una bobina combinada que consiste en bobinas de Fo8 y Halo para alcanzar estructuras cerebrales profundas. Dado que la bobina de doble cono se considera más para TMS profundos , el diseño de la bobina es la combinación de la bobina de Halo con la bobina de doble cono para proporcionar una penetración más profunda del campo eléctrico dentro de las estructuras cerebrales. La Figura 1 muestra el modelo de cabeza de hombre adulto (MIDA) con una bobina de Halo (Figura 1(a)), una bobina de doble cono (Figura 1(b)), bobinas combinadas de Halo y Fo8 (HFA) (Figura 1(c)) y una bobina de HDA (Figura 1(d)). Para comparar el rendimiento de la bobina combinada con las bobinas TMS publicadas anteriormente, modelamos la bobina de doble cono con dos devanados circulares adyacentes fijados en un ángulo de 120° de 10 vueltas con un diámetro interior y exterior de 15 mm y 40 mm, respectivamente, y la bobina de Halo con 5 devanados circulares de 150 mm y 138 mm, respectivamente . La bobina de Fo8 se encuentra a 10 mm por encima de la superficie de la piel de la cabeza para tener en cuenta el espesor de aislamiento de la bobina y la bobina de Halo a 97 mm por debajo del vértice de la cabeza . Las simulaciones se realizaron utilizando corrientes de pulso de frecuencia de 2,5 kHz, basadas en la frecuencia de pulso bifásico utilizada por los sistemas comerciales TMS. Asumimos una salida de potencia del estimulador del 100% correspondiente a una corriente eléctrica de 5 kA en las bobinas . La corriente que fluye en las dos alas vecinas del Fo8 y las bobinas de doble cono está en direcciones opuestas. Para evaluar la distribución y diseminación del campo eléctrico en diferentes tejidos cerebrales (materia gris, materia blanca, tálamo, hipotálamo, hipocampo, amígdala, núcleo accumbens y cerebelo), se calculó el porcentaje de volumen de cada tejido expuesto a una amplitud de campo eléctrico igual o superior a la mitad de la amplitud máxima del campo eléctrico en la corteza para cada bobina (V50 utilizado en ). El máximo de una distribución de amplitud corresponde a su percentil 99 en lugar del máximo para tener en cuenta posibles inexactitudes computacionales .

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Figura 1

Visión general de las bobinas magnéticas y el MIDA modelo de la cabeza. a) Bobina de halo. b) Bobina de doble cono. c) Bobina de HFA. d) Bobina HDA.

2.3. Modelo anatómico y Propiedades Dieléctricas del tejido

Se utilizó el modelo de cabeza humana MIDA para investigar la interacción del campo magnético de las bobinas con el tejido cerebral (Figura 2).

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Figura 2

MIDA modelo de cabeza: modelo de algunas estructuras representativas de la cabeza y el cuello. (piel. (b) Músculos, los músculos se muestran con las estructuras del cráneo. (c, d) Buques, los buques se muestran con y sin el GM. e) MM. f) WM. g) Cerebelo y tronco encefálico. h) Ventrículos, hipocampo, hipotálamo y amígdala .

MIDA es uno de los modelos anatómicos multimodales más avanzados basados en imágenes del cuello y la cabeza humanos. El modelo anatómico viene con estructuras únicas de alta resolución de 153, que incluyen varias estructuras cerebrales profundas distintas, capas y huesos del cráneo, y nervios , así como venas y arterias, lo que es muy relevante en nuestro estudio para distinguir diferentes estructuras cerebrales profundas y los campos eléctricos inducidos dentro de estos tejidos cerebrales. Los parámetros dieléctricos de los tejidos se establecen en base a la base de datos basada en Gabriel et al. .

2.4. Validación: Simulación versus experimentos

Para validar el software de simulación, comparamos las simulaciones numéricas de los campos magnéticos de una bobina comercial comúnmente utilizada en la implementación de TMS con mediciones de . Consideramos el Magstim Doble de 70 mm de segunda generación con control remoto . Esta bobina se compone de 9 devanados (diámetro interior y exterior de 32 mm y 48 mm, respectivamente). Se consideró una separación de 1 mm entre los devanados para tener en cuenta el espacio de aire y el aislamiento. La Figura 3 muestra el componente axial del campo magnético simulado y medido (kA / m) a una distancia de 20 mm, a lo largo de la longitud de la bobina TMS. Los cálculos muestran una buena concordancia con el campo medido. Se obtuvo una desviación relativa de 0,12% -10,75%. Observamos desviaciones más altas en el centro y los bordes, que se deben a las simplificaciones menores en el modelado de bobinas TMS.

Figura 3

Componente axial del campo magnético simulado y medido (kA / m) a una distancia de 20 mm, a lo largo de la bobina TMS (control remoto Magstim Doble de 2a generación de 70 mm).

3. Resultados y Discusiones

3.1. Distribución de campo B

La figura 4 muestra la densidad de flujo magnético en la superficie de la materia gris (GM) del modelo de cabezal MIDA para bobinas de Halo (a), cono doble (b), HFA (c) y HDA (d) para una separación igual de 10 mm y corriente igual aplicada a las dos bobinas. Se observó que el flujo magnético máximo se producía cerca de las bobinas y se descomponía rápidamente con la distancia de las bobinas para todas las configuraciones. Valores más altos de campo B en el cerebro estaban presentes en el lado derecho a medida que se aplicaban el HDA y la bobina de HFA (Figuras 4(c) y 4(d)). La comparación entre las configuraciones de doble cono (Figura 4(b)) y HDA (Figura 4(d)) muestra que la adición de la bobina de Halo resultó en una disminución del campo B en el hemisferio izquierdo en favor del hemisferio derecho. Esto se debe al hecho de que la combinación de la bobina de Halo con las bobinas de doble cono o Fo8 da como resultado que un lado (lado derecho) de la cabeza esté expuesto a la corriente positiva de las dos bobinas y el otro lado (lado izquierdo) a la corriente positiva y negativa de las bobinas. Este efecto resultará en una mayor penetración de campo en el hemisferio derecho cuando la bobina HFA y la bobina HDA funcionen. Este efecto asimétrico también se puede activar a favor del hemisferio izquierdo si invertimos la dirección de la corriente en el cono doble o en las bobinas de Fo8.

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Figura 4

densidad de flujo Magnético (valor absoluto en T) calculado en la materia gris del MIDA modelo para diferentes bobinas. a) Bobina de halo. b) Bobina de doble cono. c) Bobina de HFA. d) Bobina HDA.

3.2. Distribución del campo eléctrico

La figura 5 muestra la distribución espacial del campo eléctrico en la materia gris cerebral y la materia blanca para cada bobina TMS. Para la bobina de Halo, el campo eléctrico se produjo principalmente en la periferia de la GM (Figura 5 (a)) y la WM (Figura 5(b)) debido a la proximidad de esta región a la bobina de Halo. La Figura 5 (a) del GM muestra amplitudes E ligeramente más altas que en la Figura 5(b) del WM, lo que puede resultar en un mayor volumen de tejido expuesto a amplitudes más altas del campo eléctrico. Los valores más altos de campo eléctrico se concentraron más en el GM y el WM para la bobina de doble cono en comparación con la bobina de Halo (Figuras 5(c) y 5(d)), lo que puede dar lugar a profundidades de penetración bajas de los campos eléctricos y, por lo tanto, a una menor exposición de los tejidos cerebrales profundos a amplitudes E suficientes. Al utilizar la bobina de HFA, los campos eléctricos inducidos se incrementaron sobre las superficies GM y WM principalmente sobre el hemisferio derecho(Figuras 5(e) y 5 (f)). Los números se proporcionan en el cuadro 1 en la siguiente sección. Los resultados para este tipo de bobinas están de acuerdo con los publicados por Lu y Ueno utilizando el método de impedancia . Con la aplicación de la bobina de HDA (Figuras 5(g) y 5(h)), las distribuciones del campo eléctrico aumentaron en el hemisferio derecho y disminuyeron en el lado izquierdo en comparación con la bobina de HFA, lo que sugiere que la profundidad de penetración se puede mejorar aún más en el hemisferio derecho de los tejidos cerebrales, también se muestra en la Tabla 1 (sección siguiente). El campo eléctrico se incrementó aún más en la periferia derecha del GW y el WM para las bobinas HFA y HDA en comparación con la configuración de la bobina de Halo, lo que puede resultar en una mayor profundidad de penetración en estructuras profundas del hemisferio derecho. El campo eléctrico se redujo en la periferia izquierda del GW y el WM en comparación con la configuración de la bobina de Halo, lo que puede resultar en una menor profundidad de penetración en estructuras profundas del hemisferio izquierdo. Como se observó para la distribución del campo B, el campo eléctrico no es simétrico para las bobinas HFA y HDA debido a la distribución asimétrica del flujo magnético.

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Figura 5

Distribución del campo eléctrico (valor absoluto en V/m) en la GM (columna izquierda) y en la WM (columna derecha) para diferentes bobinas. (a, b) Bobina de Halo. (c, d) Bobina de doble cono. (e, f) Bobina de HFA. (g, h) bobina HDA.

La Figura 6 muestra la distribución del campo eléctrico en la sección transversal utilizando la bobina combinada HDA. La sección coronal(Figura 6 (b)) muestra un campo eléctrico más alto en el hemisferio derecho en comparación con el del hemisferio izquierdo para la bobina asimétrica HDA, que se esperaba de la distribución eléctrica y de la densidad de flujo en el cerebro. Los campos eléctricos más altos también están presentes en algunas estructuras profundas dentro del cerebro(en el centro de la Figura 6 (b)). La siguiente sección proporcionará una evaluación más cuantitativa del campo eléctrico extendido a las estructuras cerebrales profundas.

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Figura 6

distribución del campo Eléctrico (valor absoluto en V/m) en la sección transversal del MIDA modelo de uso de la HDA de la bobina. Vista sagital a x = 20 cm. (b)Vista coronal a y = 20 cm.

3.3. Propagación del campo eléctrico en Estructuras Cerebrales Profundas

Para cuantificar la propagación y penetración del campo eléctrico, la Tabla 1 muestra el porcentaje de volumen de cada tejido donde la amplitud del campo eléctrico es mayor que la mitad del pico de E en la corteza para cada bobina (V50). Debido al hecho de que las diferentes distribuciones de campo ocurren en el hemisferio derecho e izquierdo de los tejidos cerebrales, se calculó el porcentaje de volumen de cada tejido cerebral para ambos lados del cerebro para las bobinas de HFA y HDA (las bobinas de doble cono y Halo son bobinas simétricas). HFA_R y HDA_R se refieren al porcentaje de volumen de cada tejido cerebral en el lado derecho utilizando las bobinas de HFA y HDA, respectivamente. HFA_L y HDA_L se refieren al porcentaje de volumen de cada tejido cerebral en el lado izquierdo utilizando las bobinas de HFA y HDA, respectivamente. Los resultados muestran que V50 en el hemisferio derecho es mayor que el del hemisferio izquierdo para las bobinas asimétricas, lo que se esperaba de la distribución eléctrica y de la densidad de flujo en el cerebro (Figuras 4 y 5). Este efecto es más notable para las estructuras más profundas como el hipocampo y el núcleo accumbens, donde el V50 es de 0,04% y 1,21% en el lado derecho del hipocampo y el núcleo accumbens, respectivamente, mientras que este porcentaje es igual a cero en el lado izquierdo (para la bobina HDA). Una comparación entre el HDA y las bobinas de HFA muestra que se puede alcanzar un mayor porcentaje del lado derecho de las estructuras profundas (hipocampo, núcleo accumbens y cerebelo) con el HDA en comparación con el HFA (V50 igual a 6,2% y 3,24% para el lado derecho del cerebelo cuando se usan las bobinas de HDA y HFA, respectivamente. El hipocampo y el núcleo accumbens solo se pueden alcanzar cuando se usa la bobina HDA con V50 igual a 0,04% y 1,21% para hipocampo y núcleo accumbens, respectivamente). Esta ventaja de la bobina HDA (V50 de HDA_L: 21,77%, 20,18% y 1.94% para GM, WM y cerebelo, respectivamente) sobre la bobina de HFA (V50 de HFA_L: 21,54%, 20,44% y 1,85% para GM, WM y cerebelo, respectivamente) es menos importante en el lado izquierdo de los tejidos cerebrales. La bobina de Halo se dirige a estructuras más profundas en el cerebro (V50 igual a 2,12% para el cerebelo con la bobina de Halo) incluso sin usar una bobina combinada y amplitudes altas extendidas del campo eléctrico (V50 de Halo: 23,96%, 22,13% y 2,12% para GM, WM y cerebelo, respectivamente) más grandes que las bobinas de HDA y HFA en el lado izquierdo de los tejidos cerebrales. Doble cono (V50 de CC: 26,69% y 24.27%, para GM y WM, respectivamente) y las bobinas Halo proporcionan una distribución de campos más grande en el lado izquierdo de WM y GM que las bobinas HDA y HFA debido a la distribución asimétrica del flujo magnético. El tálamo, el hipotálamo y la amígdala tienen 0% de V50 para cada configuración de bobina. Todas las bobinas con V50>0 pueden alcanzar materia gris y blanca. De nuevo, se obtuvieron los valores más altos para las bobinas de HFA y HDA.

Para el propósito de un TMS profundo, una buena bobina debe caracterizarse por una alta profundidad de penetración y una alta focalidad (es decir, un V50 bajo). En la Tabla 1, podemos ver que la bobina de doble cono proporciona una mejor focalidad en la materia gris y blanca en comparación con las bobinas HDA en el hemisferio derecho (V50 igual a 26.7 y 33.8 para DC y HDA, respectivamente), pero en detrimento de una menor profundidad de penetración. De hecho, la bobina de CC es incapaz de alcanzar una estructura más profunda como el hipocampo y el núcleo accumbens, donde el V50 de la bobina HDA es igual a 0,04% y 1,21% en el lado derecho del hipocampo y el núcleo accumbens, respectivamente. Este compromiso de focalidad de profundidad es inherente a la mayoría de las bobinas TMS. Las bobinas que se caracterizan por una mayor profundidad de penetración (HDA y HFA) podrían al mismo tiempo inducir una gran amplitud de campo en un área muy amplia de la corteza (Tabla 1). Por otro lado, las bobinas con una distribución de amplitud de campo eléctrico más focal (CC y Halo) no son capaces de alcanzar estructuras cerebrales profundas (Tabla 1). Ninguna de las bobinas propuestas es capaz de superar este compromiso, como sugiere también el trabajo anterior, ya que alcanzar estructuras cerebrales más profundas implica un campo eléctrico más amplio extendido en la superficie cortical.

4. Conclusión

Se ha investigado numéricamente una bobina de doble cono combinada con una bobina de Halo y se ha caracterizado para la estimulación cerebral profunda utilizando modelos de cabeza heterogéneos anatómicamente realistas. Se obtuvo la distribución 3D del campo B y del campo eléctrico para bobinas de Halo, doble cono, HFA y HDA. La propagación de los campos eléctricos se calculó y comparó para diferentes tejidos cerebrales, incluidos los tejidos cerebrales profundos (tálamo, hipotálamo, amígdala, hipocampo, núcleo accumbens y cerebelo) utilizando bobinas de Halo, doble cono, HDA y HFA, y mostró que la distribución asimétrica del campo magnético producida por la bobina HDA mejoró la propagación del campo eléctrico dentro de las estructuras cerebrales profundas (hipocampo, núcleo accumbens y cerebelo) y, por lo tanto, permitió la estimulación del cerebro a mayores profundidades. Las limitaciones de la versión actual del modelo numérico deben incluir la ausencia de la incorporación adecuada de la anisotropía tisular, especialmente en la materia blanca, lo que aumentaría la precisión del modelo y podría afectar la distribución del campo eléctrico . La sensibilidad de la posición de las bobinas también debe realizarse en el futuro para caracterizar su efecto de los campos inducidos.

Disponibilidad de los datos

Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles a petición del autor correspondiente.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

La investigación fue apoyada por COST Action BM1309 (COST EMF-MED) y el Proyecto FWO G003415N. E. Tanghe es becaria postdoctoral de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO-V).