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Cuantificación del ARN del VHC.

El objetivo de este estudio fue desarrollar un ensayo QRT-PCR simple y en tiempo real para la cuantificación del ARN del VHC en muestras de suero e hígado con detección de SYBR Green I en lugar del uso de sondas etiquetadas. Los ensayos QRT-PCR en tiempo real se realizaron con un LightCycler (Roche) con amplificación de una sola ronda y una nueva amplificación anidada de ciclo limitado. Los estándares de ARN se transcribieron con polimerasa T7 a partir de amplicones derivados de productos de PCR de región 5′ sin traducir clonados en pGEM-T Easy (Promega) y tratados dos veces con DNasa RQ1. El ARN se cuantificó por espectrofotometría. Para la cuantificación de muestras de suero de una sola ronda, el ARN se transcribió de forma inversa como se describió anteriormente (7). Para la cuantificación de PCR anidada de ciclo limitado, se realizó una PCR-RT en una reacción de un solo paso con 15 ciclos de PCR (el paso de ciclo limitado), seguido de una PCR-QRT en tiempo real. Las cargas de VHC se midieron mediante PCR en tiempo real con cebadores externos KY78 y KY80 para reacciones de un solo ciclo (21) o cebadores externos más cebadores internos hep21b y hep22 para reacciones anidadas de ciclo limitado (19). Las mezclas de reacción incluyeron 2 µl de ADN Maestro de Arranque rápido SYBR Green I (Roche), 4 mm MgCl2, una concentración de 0,5 µM de cada imprimación y 2 µl de la plantilla en un volumen total de 20 µl. Después de incubaciones de 10 min a 95 ° C, se realizó la PCR del LightCycler durante 40 ciclos, cada ciclo consistió en 15 s a 95°C, recocido a 60°C durante 5 s y extensión a 72°C durante 10 s. Se monitorizó la fluorescencia a 530 nm y se comprobó la especificidad de la señal mediante análisis de curva de fusión.

Con ARN del VHC sintético como plantilla, la sensibilidad del ensayo QRT-PCR en tiempo real de una sola ronda fue de aproximadamente 103 copias/reacción del VHC o 5 × 104 copias/ml cuando se calculó el factor de dilución. Se observó una amplia relación lineal (hasta 6,5 × 108 copias/reacción) entre el número de ciclos de PCR necesarios para detectar una señal de fluorescencia y el número de copias del VHC. Medimos la carga viral sérica de 24 pacientes infectados crónicamente con varios genotipos del VHC prevalentes en Australia (1a, 1b, 2a, 2b, 2c y 3a) (6). Tres pacientes presentaron cargas virales inferiores a la sensibilidad de esta versión del ensayo (5 × 104 copias/ml), aunque dieron positivo en un ensayo cualitativo interno de RT-PCR anidado (19). Los 21 pacientes restantes tenían cargas virales que oscilaban entre 2,8 × 105 y 9,1 × 106 copias/ml. Para aumentar la sensibilidad y especificidad del ensayo, se introdujo una PCR RT de 15 ciclos en un solo paso con una PCR cuantitativa en tiempo real posterior para la segunda ronda. Con ARN sintético, el método modificado fue capaz de detectar un amplio rango de números de copias del VHC (de 28 a 2,8 × 106 copias/reacción del VHC), manteniendo al mismo tiempo la linealidad. La sensibilidad del ensayo QRT-PCR anidado de ciclo limitado fue superior a 28 copias/reacción (o 1.400 copias/ml), que fue aproximadamente 40 veces mayor que la del ensayo QRT-PCR de una sola ronda. La sensibilidad de este ensayo se compara favorablemente con la de los métodos notificados anteriormente que utilizan cuantificación en tiempo real con tecnología TaqMan (Roche) y un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer), que han informado sensibilidades de 10 copias/reacción (9, 16) y 1.000 copias/reacción (12). También se ha notificado que la sensibilidad de la detección de LightCycler (Roche) y SYBR Green I es de 10 copias/reacción (10). Para validar aún más esta versión del ensayo, las cargas virales de 16 muestras de suero con VHC positivo, que oscilaron entre 1 × 103 y 1.Se demostró que 2 × 106 copias/ml (según se determinó con el ensayo Amplicor Monitor) se correlacionaban estrechamente con los resultados obtenidos con el ensayo QRT-PCR en tiempo real anidado (r= 0,876, P < 0,0001, n = 16) (Fig. (Higo.11).

Réplicas del VHC en el hígado, sin embargo, pocos estudios han intentado relacionar la carga viral en el hígado con los resultados clínicos, prefiriendo examinar el valor predictivo de la carga viral en suero. Este último podría considerarse un sustituto adecuado para la carga viral hepática si se demostrara que se correlacionan, sin embargo, pocos estudios lo han demostrado y los resultados reportados hasta la fecha no son convincentes. Por lo tanto, se utilizó el ensayo QRT-PCR anidado de ciclo limitado para medir las cargas hepáticas de VHC. La cantidad de tejido hepático utilizado para el análisis pesó entre 0,8 y 8,1 mg (media = 3.88 ± 2,1 mg), de los que se extrajeron 2,1 a 12,9 µg (media = 6,62 ± 3,1 µg) de ARN. El rendimiento del ARN total promedió 1,71 × 103 µg/g de tejido hepático, un valor similar al encontrado en un estudio anterior de 1,01 × 103 µg de ARN/g (13). Hepática carga viral osciló entre 3.0 × 102 1.3 × 106 moléculas de ARN del VHC/µg de ARN total, y el promedio fue de 2.38 × 105 ± 3.55 × 105 copias/µg de ARN. Se ha demostrado una correlación entre la carga viral hepática, medida en términos del número de copias del VHC por microgramo de ARN total, y la carga viral sérica medida con el ensayo Amplicor Monitor, aunque fue débil (r = 0,417, n = 20) (13). Otros estudios han demostrado que la carga de ARN del VHC en el suero se refleja sustancialmente en la cantidad de virus en el hígado sin proporcionar coeficientes de correlación (3, 8). Aquí, reportamos por primera vez una correlación estadísticamente significativa entre las mediciones de carga viral hepática y sérica (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), lo que indica que el nivel de viremia refleja, de hecho, la cantidad de virus presente en el hígado (Fig. (Higo.22).

En estudios previos, las mediciones de la carga viral hepática se han expresado como el número de copias por miligramo de tejido hepático o el número de copias por microgramos de ARN total. En este estudio, mostramos que cualquiera de las dos unidades parece ser adecuada, ya que hubo una correlación significativa entre las cargas virales medidas en términos del número de copias por miligramo de tejido hepático y las medidas como el número de copias por microgramo de ARN total (r = 0,937, P < 0,0001, n = 20) (Fig. (Higo.3).3). Estos resultados son consistentes con los de De Moliner et al. (3), la oms también demostró una estrecha correlación entre la carga viral en el hígado, expresada como el número de copias por gramo de tejido, y el número de copias por microgramo de ARN celular total (r = 0,85) (3). El número medio de moléculas de ARN del VHC por gramo de tejido hepático fue de 2,1 × 108 ± 3,71 × 108, alrededor de 170 veces más alto que los niveles de ARN en suero (1,22 × 106 ± 2,0 × 106 copias/ml). Este hallazgo es similar al de Terrault et al. (18), que mostraron que la relación entre el ARN del VHC en el hígado y el sérico era de 103:1. En contraste, McGuiness et al. (13) encontraron que el nivel en el tejido hepático era mayor por un factor de >104. Esta diferencia puede estar relacionada con el hecho de que la carga viral hepática de los pacientes del estudio anterior, predominantemente con infección avanzada por VHC, era alrededor de ocho veces mayor (1,83 × 106 ± 0,75 × 106 copias/µg de ARN) que la registrada en el presente estudio (2,38 × 105 ± 3,55 × 105 copias/µg de ARN).

En conclusión, el ensayo QRT-PCR en tiempo real es un método sensible, preciso y fiable para la monitorización de las cargas de VHC en muestras de suero e hígado.