Braz J Med Biol Res, mai 2004, Volume 37(5) 625-634
L’utilisation de la transcription inverse-PCR pour le diagnostic de la maladie granulomateuse chronique liée à l’X
P. Agudelo-Flórez1, J.A. López1, J. Redher1, M.M.S. Carneiro-Sampaio2, B.T. Costa-Carvalho3, A.S. Grumach4 et A. Condino-Neto1
1Centre de Recherche en Pédiatrie et Départements de Pédiatrie et de Pharmacologie, Faculté des Sciences médicales, Université d’État de Campinas, Campinas, SP, Brésil
2département d’Immunologie, Institut des Sciences Biomédicales, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brésil.
3Discipline d’Allergie, d’Immunologie et de Rhumatologie, Département de Pédiatrie, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brésil.
4Laboratório Recherche médicale 56, Département de Dermatologie, Faculté de Médecine,, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brésil
Résumé
Introduction
Patients et méthodes
Résultats
Discussion Remerciements
Correspondance et notes de bas de page
Résumé 
La maladie granulomateuse chronique (MCG) est un trouble héréditaire du système immunitaire inné caractérisé par une explosion oxydative défectueuse des phagocytes et une altération subséquente de leur activité microbicide. Des mutations dans l’un des composants de la NADPH-oxydase affectent l’expression génique ou la fonction de ce système, conduisant au phénotype de la CGD. Les défauts du gp91-phox entraînent une MCG liée à l’X, responsable d’environ 70% des cas de MCG. L’étude du génotype hautement hétérogène des patients atteints de CGD comprend une analyse de mutation, des tests de Northern blot ou de Western blot selon le cas particulier. L’objectif de la présente étude était d’utiliser la transcription inverse (RT)-PCR pour l’analyse des défauts moléculaires responsables de la CGD liée à l’X chez huit patients brésiliens et d’évaluer son potentiel d’application plus large au criblage moléculaire dans la CGD. L’ARN total a été préparé à partir de lymphocytes B transformés par le virus d’Epstein B et transcrit en inverse à l’aide d’hexamères aléatoires. L’ADNc résultant a été amplifié par PCR par des paires d’amorces spécifiques et superposées conçues pour amplifier trois régions du gène gp91-phox: les exons 1-5, 3-9 et 7-13. Cette stratégie a permis de détecter une expression défectueuse du gp91-phox chez sept patients. Les résultats de la RT-PCR correspondaient aux antécédents cliniques, aux données biochimiques (dosage de libération de tétrazolium ou de superoxyde de nitroblue) et à l’analyse de mutation disponible dans quatre cas. Dans trois autres cas, les résultats de la RT-PCR correspondaient aux antécédents cliniques et aux données biochimiques. Dans un autre cas, la RT-PCR était normale malgré des antécédents cliniques compatibles avec la CGD et une rupture respiratoire défectueuse. Nous concluons que cette nouvelle application de l’analyse RT-PCR – une méthode simple, économique et rapide – était appropriée pour le dépistage des défauts moléculaires chez 7 des 8 patients atteints de MCG liés à l’X.
Mots clés: Superoxyde, Phagocytes, immunodéficience primaire, Éclatement respiratoire, Neutrophiles, Humain
Introduction
La maladie granulomateuse chronique (CGD) est une immunodéficience primaire décrite à l’origine en 1957 comme une entité clinique affectant les nourrissons de sexe masculin et nommée, à l’époque, maladie granulomateuse mortelle de l’enfance. Les principales caractéristiques de la MCG sont des infections récurrentes et graves impliquant les barrières naturelles de l’organisme telles que les voies respiratoires et les ganglions lymphatiques, et éventuellement des structures internes telles que le foie, la rate, les os et le cerveau (1-3). L’incidence estimée de cette maladie rare est de 1/250 000 naissances vivantes par an. Les infections sont généralement causées par des bactéries catalases négatives telles que Staphylococcus aureus, des bacilles à Gram négatif et des espèces fongiques telles que Aspergillus, Candida et Nocardia (4,5).
Le système NADPH-oxydase génère du superoxyde et d’autres intermédiaires réactifs de l’oxygène, essentiels à l’activité microbicide des phagocytes. Le défaut biochimique de la CGD est une altération de l’activité de la NADPH-oxydase et une incapacité subséquente à détruire les microorganismes (6). Les principaux composants du système NADPH-oxydase sont gp91-, p22-, p47-, p67- et p40-phox. Les défauts moléculaires à l’origine de la CGD sont généralement dus à l’absence, à une faible expression ou à un dysfonctionnement de l’un des composants de la NADPH-oxydase. La forme liée à l’X de cette maladie est causée par des défauts de la gp91-phox, la chaîne lourde du cytochrome b588, et représente environ 70% de tous les cas (7,8). Les formes autosomiques récessives sont causées par des défauts de l’un des composants cytosoliques de la NADPH oxydase (p47- ou p67-phox, respectivement dans 20 et 5% des cas), ou du composant de la chaîne légère du cytochrome b588 (p22-phox, 5% des cas) (9,10). La CGD est une condition très hétérogène : plus de 300 mutations ont été enregistrées dans une base de données X-CGD maintenue à l’échelle internationale (8). Les mutations ont été réparties en grande partie dans les 13 exons ou aux limites exon/intron du gène gp91-phox (CYBB) et près de 200 de ces mutations sont uniques.
Le diagnostic de CGD est généralement basé sur les caractéristiques cliniques de la maladie ainsi que sur l’activité défectueuse de la NADPH-oxydase, comme le démontrent les tests de libération anormaux de nitroblue tétrazolium (NBT), de dihydrorhodamine 123 ou de superoxyde (11,12). Dans le test NBT stimulé, les individus normaux présentent près de 100% de cellules positives, tandis que chez les patients atteints de CGD, moins de 5% des cellules sont positives (13). De plus, les cellules de patients présentant une variante de CGD sont positives, mais ne montrent qu’une très faible activité (6). Le test NBT détecte également les porteurs de la CGD liée à l’X (mères et sœurs). Un diagnostic définitif de CGD moléculaire est établi chez les patients présentant un test NBT anormal ou une activité d’éclatement respiratoire présentant l’une des caractéristiques suivantes: une mutation de gp91-, p22-, p47- ou p67-phox; un ARNm absent pour l’un de ces gènes détecté par analyse Northern blot; et / ou une protéine absente pour l’un de ces composants oxydase par Western blot. Un diagnostic génétique, mais non moléculaire, peut être établi par la démonstration de cousins, oncles ou neveux maternels présentant un test NBT anormal ou une rafale respiratoire (14). Ainsi, l’établissement d’un diagnostic définitif de cette maladie rare et très hétérogène nécessite des méthodologies complexes et coûteuses telles qu’une combinaison de Northern blot ou Western blot, et une analyse de polymorphisme de conformation simple brin (SSCP) suivie d’un séquençage de l’ADN de plusieurs membres de la famille, le tout effectué dans des laboratoires de recherche de grande complexité.
La méthode de transcription inverse-PCR (RT-PCR) implique l’amplification de l’ADNc par PCR. Cette technique peut être facilement standardisée dans des laboratoires moins sophistiqués. Il fournit des informations sur l’expression des gènes et des données préliminaires sur la structure ou la taille de l’ARNm du composant défectueux. La RT-PCR a rarement été utilisée dans la recherche sur la CGD, se limitant aux études de physiopathologie (15-29). À ce jour, l’utilisation potentielle de cet outil utile pour établir le diagnostic définitif de la CGD liée à l’X, la forme la plus fréquente, n’a pas fait l’objet d’études approfondies. Le but de la présente étude était d’évaluer l’utilisation de la RT-PCR pour le dépistage des défauts moléculaires responsables de la CGD liée à l’X, une immunodéficience rare et peut-être mal diagnostiquée, chez huit patients brésiliens.
Patients et méthodes
Patients
L’étude a inclus 8 patients brésiliens masculins non apparentés présentant une MCG probable liée à l’X (2 Noirs et 6 Caucasiens; âge 2-8 ans; taille 88-108 cm; poids 11-19 kg). Les patients présentaient des antécédents cliniques d’infections graves récurrentes telles que pneumonie, lymphadénite, abcès du foie, pyodermite et effets indésirables à l’immunisation par le BCG. Ils ont été dirigés vers notre laboratoire pour une évaluation diagnostique biochimique et moléculaire. Le consentement éclairé écrit a été obtenu des participants avant l’étude. Le Comité d’éthique de l’École de médecine a approuvé le protocole conformément à la Convention d’Helsinki et à la Résolution 196/96 du Ministère brésilien de la Santé.
Diagnostic biochimique de la MCG
Le diagnostic biochimique de la MCG a été établi selon les critères du Groupe panaméricain pour les immunodéficiences. Une altération de l’activité de la NADPH-oxydase a été démontrée par le test de glissement NBT et / ou le test de libération d’anions superoxydes par les neutrophiles du sang périphérique et les leucocytes mononucléaires (14,30,31). Les neutrophiles et les leucocytes mononucléaires ont été obtenus par centrifugation d’échantillons sanguins sur un gradient de densité Ficoll-Hypaque (32).
Le test de glissement NBT était basé sur la réduction du NBT en formazan par les leucocytes activés (31). Le dosage a été effectué comme décrit précédemment (30). Plus de 95% des 200 neutrophiles normaux stimulés par 30 nM de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) devraient pouvoir réduire le NBT. Une réaction absente ou < 5% de cellules positives a été considérée comme indiquant un diagnostic de CGD (14).
La libération quantitative de superoxyde par les neutrophiles et les leucocytes mononucléaires a été évaluée par un essai de réduction du cytochrome c inhibé par la superoxyde dismutase modifiée (33-35). La quantité de superoxyde libérée a été calculée en utilisant un coefficient d’extinction de 0,21 nM / cm pour le cytochrome c. Les résultats sont rapportés sous forme de superoxyde de nmol libéré par 106 cellules par heure. Les patients atteints de MCG présentaient moins de 10% des valeurs témoins.
Criblage des défauts moléculaires responsables de la CGD liée à l’X
Les lymphocytes B de patients atteints de CGD liée à l’X ont été transformés in vitro avec le virus Epstein B (EBV) (15,16) afin de fournir une source abondante d’acides nucléiques pour les études moléculaires. Les lignées de cellules B transformées en EBV reproduisent les défauts biochimiques et moléculaires des patients atteints de CGD (15,16,36) et éliminent le besoin de prélèvements sanguins répétés. Brièvement, les leucocytes du sang périphérique de patients atteints de MCG liés à l’X ont été cultivés avec des surnageants de B95-8, une lignée cellulaire productrice d’EBV (15,16,36,37), dans un milieu RPMI 1640 additionné de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (10%), de L-glutamine de 2 mM, de pénicilline de 100 U / ml et de streptomycine de 100 µg / ml, à 37ºC, dans une atmosphère humide avec 5% de CO2. La viabilité cellulaire a été surveillée et les cultures ont été maintenues tout au long de la période d’étude.
Des échantillons d’ARN provenant de lignées de cellules B transformées en EBV ont été préparés par la méthode de la guanidine HCl, suivie d’une précipitation à l’éthanol et d’une quantification par des méthodes standard (38,39). Les échantillons d’ADNc ont été obtenus par transcription inverse de 2 µg d’ARN total avec l’exposant II RT (GIBCO BRL) et des hexamères aléatoires (15). La qualité des échantillons d’ARNm a été vérifiée par amplification PCR de la ß-actine, un contrôle génétique constitutif (bp 920-943 et bp 1494-1471) (Gen Bank accession No. NM001101).
l’expression du gène gp91-phox a été évaluée par RT-PCR. Paires d’amorces spécifiques et superposées (No d’adhésion de la banque Gen. NM_000397, Tableau 1) ont été utilisés pour amplifier (30 cycles) trois régions exoniques gp91-phox : 1-5, 3-9 et 7-13. Cette stratégie nous a permis de cribler tous les exons gp91-phox. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose à 2% et colorés au bromure d’éthidium.
L’expression relative du gène gp91-phox a été analysée avec le logiciel Image Master (Pharmacia-Biotech). Le résultat de la densitométrie pour les échantillons cibles a été divisé par le résultat de la densitométrie de la ß-actine, un contrôle génétique constitutif, normalisant le niveau considéré pour l’analyse. Les résultats des essais de RT-PCR ont été comparés aux antécédents cliniques du patient, aux essais biochimiques (test de libération de NBT et/ou de superoxyde) et aux données d’analyse de mutation disponibles (indice http://www.sbi.org.br/Sbi2003/.htm).
Résultats
Nous avons étudié 8 patients de sexe masculin ayant des antécédents cliniques d’infections graves récurrentes, référés à notre laboratoire pour le diagnostic biochimique et moléculaire de la CGD. Les résultats des essais sur lames NBT et des essais de libération de superoxyde sont présentés dans le tableau 2. Six des patients présentaient moins de 5% de leucocytes positifs dans le test de diapositives NBT. Six patients ont présenté une altération de la libération de superoxyde par les granulocytes et / ou les leucocytes mononucléaires (moins de 10% par rapport aux témoins sains). Quatre patients ont eu des résultats anormaux dans les deux tests. Tous les patients ont présenté au moins un test anormal et ont reçu le diagnostic de CGD probable liée à l’X. La mère et la sœur du patient T.B.P. ont présenté un test de glissement NBT compatible avec le statut de porteur de la CGD liée à l’X. Au cours de la période d’étude, un patient (G.M.) est décédé d’une pneumonie.
Nous avons ensuite étudié le diagnostic définitif de la CGD liée à l’X par analyse RT-PCR de l’expression du gène gp91-phox. Les résultats de l’amplification RT-PCR avec trois jeux d’amorces superposées sont présentés dans le tableau 2. La qualité de l’échantillon d’ARNm a été vérifiée par amplification PCR de la ß-actine, un contrôle génétique constitutif. Les produits normaux attendus ont été obtenus dans ce cas (Figures 1, 2 et 3).
Dans quatre cas, il a été possible de faire correspondre les données de RT-PCR avec l’analyse de mutation disponible, présentée ailleurs par Patiño et al. (30) ou par notre groupe (//www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm ) : J.E.M. a présenté une transition C469®T dans l’exon 5, prédisant une mutation non-sens (R157X). M.F. a présenté une substitution non-sens dans l’exon 3, R(arginine) 73-Stop. R.S. a montré une substitution de 264 G®A à la jonction d’épissure 3′ de l’exon 3 gp91-phox. La séquence d’ADNc a montré une délétion de l’exon 3 gp91-phox, donnant naissance à un mutant instable ou non fonctionnel gp91-phox. G.G. présenté un épissage défectueux de l’exon 3 gp91-phox (la mutation sous-jacente n’a pas encore été déterminée). Les autres patients continuent à faire l’objet d’une enquête.
Dans son ensemble, cette stratégie a permis de détecter une expression défectueuse du gp91-phox chez sept patients sur huit. Les résultats de la RT-PCR correspondaient aux antécédents cliniques, aux données biochimiques (test de libération de NBT ou de superoxyde) et à l’analyse de mutation disponible dans quatre cas. Dans trois autres cas, les résultats de la RT-PCR correspondaient aux antécédents cliniques et aux données biochimiques. Dans un autre cas, la RT-PCR était normale malgré des antécédents cliniques compatibles avec la CGD, une rafale respiratoire défectueuse caractérisée par le test NBT et le test de libération de superoxyde et des tests NBT de sa mère et de sa sœur compatibles avec le statut de porteur de la CGD liée à l’X.
Discussion
Cet article rend compte des études biochimiques et d’expression génique de 8 patients masculins brésiliens non apparentés ayant des antécédents cliniques de CGD, qui ont été référés à notre laboratoire pour une investigation détaillée. La CGD est un trouble héréditaire rare dans lequel les cellules phagocytaires sont incapables de générer de l’anion superoxyde et d’autres intermédiaires réactifs de l’oxygène. Nous avons d’abord établi le diagnostic de la CGD probable liée à l’X au moyen de méthodes biochimiques telles que les tests de lames NBT et / ou les tests de libération d’anions superoxydes. Nos résultats ont montré que tous les patients présentaient une altération de la fonction NADPH-oxydase et, à leur tour, une CGD probable liée à l’X.
Les deux méthodes contribuent au diagnostic probable de la MCG de différentes manières. Le test de glissement NBT fournit des informations sur le nombre de cellules qui réduisent le NBT en formazan à l’intérieur du cytoplasme et l’intensité de cette réduction. Ainsi, les patients présentant des formes variantes de CGD liées à l’X présentent des tests de diapositives NBT anormaux, dans lesquels la plupart des cellules réduisent faiblement le NBT en formazan. Le test de glissement NBT détecte également les porteuses de CGD liées à l’X. Le test de libération de superoxyde mesure la réduction du cytochrome c par le superoxyde produit par les leucocytes activés présents dans la réaction, permettant le diagnostic de formes variantes de CGD liées à l’X. Les deux tests peuvent être facilement standardisés dans des laboratoires de faible complexité et aucun ne nécessite d’équipement coûteux. Le test de dihydrorhodamine 123 est une méthode très sensible pour le diagnostic biochimique de la CGD; cependant, il nécessite un cytomètre en flux, un instrument très coûteux.
Nous avons évalué l’expression du gène gp91-phox dans les lymphocytes B transformés par EBV de patients atteints de CGD par analyse RT-PCR. Des paires d’amorces spécifiques et superposées ont été utilisées pour amplifier trois régions du gène gp91-phox par RT-PCR: les exons 1-5, 3-9 et 7-13. Cette stratégie a permis de détecter une expression défectueuse du gp91-phox chez 7 patients sur 8. Les résultats de la RT-PCR correspondaient aux antécédents cliniques, aux données biochimiques (test de libération de NBT ou de superoxyde) et à l’analyse de mutation disponible dans quatre cas. Dans trois autres cas, les résultats de la RT-PCR correspondaient aux antécédents cliniques et aux données biochimiques.
l’expression du gène gp91-phox a été réduite dans toutes les régions exoniques du patient R.B. Cette réduction peut être le résultat de mutations conduisant à une faible stabilité de l’ARN ou à une activité transcriptionnelle altérée. Patients G.M. et T.P. a montré l’absence d’expression des exons 7-13, suggérant que la diminution de l’expression de ces exons d’extrémité 3′ supplémentaires peut être le résultat d’une instabilité de l’ARN ou d’un défaut d’épissage, par exemple un épissage partiellement correct pour produire un signal, mais un épissage partiellement anormal pour éliminer un site de liaison de l’amorce, sujet à étudier par de futures analyses de mutation de l’ADN génomique.
Le patient G.G. a présenté un produit diffus, peu abondant, de plus petite taille d’exons 1-5 (Figure 1) et une expression absente d’autres régions exoniques. Son analyse de mutation a montré un défaut au site d’épissure de l’exon 3. De même, l’analyse de mutation du patient R.S. a également révélé un défaut au site d’épissure de l’exon 3. Cependant, dans ce cas, un produit PCR moins abondant pourrait être détecté.
Le patient M.F. a présenté une expression réduite des régions exoniques 3-9 et 7-13, qui peut être le résultat d’une activité transcriptionnelle défectueuse dans l’exon 3. J.E.M. a présenté une mutation non-sens dans l’exon 5 qui a entraîné une perte de l’expression de gp91-phox, comme en témoigne l’analyse RT-PCR, une conséquence possible de l’instabilité de l’ARNm médiée par un non-sens.
Dans un cas, le patient T.P.B., l’expression du gène gp91-phox était normale malgré des antécédents familiaux compatibles avec la CGD et une activité respiratoire défectueuse. Dans ce cas, le diagnostic de CGD probable liée à l’X était basé sur des tests NBT anormaux chez sa mère et sa sœur, compatibles avec le statut de porteuse. Nous émettons l’hypothèse qu’une mutation ponctuelle, telle qu’une substitution de base unique qui ne modifie pas la longueur ou l’abondance des fragments de PCR, devrait être étudiée dans ce cas particulier.
La RT-PCR est un outil puissant pour évaluer l’expression des gènes. Cette caractéristique peut expliquer en partie la variabilité de l’expression du gène gp91-phox chez les patients inclus dans cette étude, et l’importance de combiner une paire d’amorces qui se chevauchent pour filtrer toute la longueur du message. La RT-PCR a été utilisée dans des études de cas isolées dans le cadre du diagnostic initial des différentes formes de CGD (17-22). L’analyse RT-PCR a également été utile dans le diagnostic prénatal de la MCG, résultant d’un déficit en p47-phox (23). Cependant, il a été plus couramment utilisé pour l’étude de la régulation génique des composants de la NADPH-oxydase dans une variété de cellules (15,16,24-29). À ce jour, l’utilisation potentielle de cet outil utile pour établir le diagnostic définitif de la CGD liée à l’X, la forme la plus fréquente, n’a pas fait l’objet d’études approfondies. D’autres études devraient être effectuées pour comparer la sensibilité et la spécificité de ce test par rapport à d’autres tests complexes tels que les blots Western ou Northern.
Dans l’ensemble, nous avons démontré que la RT-PCR, une méthodologie simple et peu coûteuse, établissait le diagnostic définitif de la CGD liée à l’X dans 7 des 8 cas, sans qu’il soit nécessaire d’utiliser des méthodologies complexes et coûteuses telles que le Northern blot, le slot blot, l’analyse SSCP ou le séquençage de l’ADN génomique. Ainsi, la RT-PCR peut être un outil approprié pour diagnostiquer la CGD dans les laboratoires des pays en développement. Il est très important de déterminer le défaut génétique moléculaire définitif afin de fournir le conseil génétique et le pronostic appropriés aux kindreds atteints de CGD. De plus, des études de génétique moléculaire du système NADPH-oxydase humain feront progresser les connaissances sur ce mécanisme de défense crucial et ancien.
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39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger PE & Weissman SM (1999). Une méthode modifiée pour l’affichage de fragments de restriction d’extrémité 3′ d’ADNC: Profilage moléculaire de l’expression génique chez les neutrophiles. Méthodes enzymologie, 303: 272-297.
Remerciements
Les auteurs remercient les patients et leurs familles pour leur participation et leur aide, ainsi que l’infirmière Silvana Severino pour l’assistance technique. Les auteurs remercient également le professeur Peter Newburger, de la Faculté de médecine de l’Université du Massachusetts, pour son examen critique de ce manuscrit.
Correspondance et notes de bas de page