L’isolamento e l’espansione a lungo termine delle cellule primarie, in particolare delle popolazioni staminali/progenitrici, sono tecniche di base fondamentali e importanti in vari campi biologici, tra cui la biologia dello sviluppo e Le cellule nei tessuti epiteliali stratificati e colonnari sono altamente rigenerative e sproporzionatamente responsabili di molti tumori umani; tuttavia, la clonazione delle cellule staminali adulte è limitata dalle difficoltà nel mantenere queste cellule in uno stato immaturo. Negli ultimi anni, le innovazioni tecniche hanno portato a rapidi e drammatici progressi nella biologia delle cellule staminali, come l’uso di piccole molecole e fattori di crescita per imitare ambienti di nicchia tissutale e facilitare la “cultura organoide” .
Nel 1975, Rheinwald e Green hanno stabilito il primo esempio di successo di coltura di cellule staminali umane adulte utilizzando cheratinociti umani . In particolare, hanno mantenuto cheratinociti umani a lungo termine in combinazione con una linea cellulare di fibroblasti di topo irradiata subletalmente, 3T3-J2. Anche se non hanno usato il termine “cellule staminali” per i cheratinociti clonati cresciuti su cellule 3T3, Green e colleghi hanno trovato colonie con la notevole capacità di dividere e formare nuove colonie dopo il passaggio, che hanno definito “Holocloni” . Questi olocloni sono costituiti da piccole cellule immature che hanno mostrato un’intensa colorazione nucleare con p63, un regolatore principale della staminali, in cellule epiteliali stratificate . Nell’epitelio stratificato, tra cui pelle, bronchi polmonari, ghiandola mammaria e urotelio vescicale, la popolazione di cellule staminali era localizzata principalmente nello strato basale e le cellule immature erano colorate con p63, in linea con gli studi in vitro . Significativamente, i cheratinociti umani isolati ed espansi dalla pelle autologa sono stati innestati con successo per bruciare i pazienti e rigenerare un’epidermide permanente simile a quella risultante da innesti cutanei a spessore diviso . In particolare, la stessa procedura è stata applicata per isolare ed espandere le cellule epiteliali corneali umane per il trapianto . Sebbene questa tecnologia fosse limitata alle cellule staminali nell’epidermide e nella cornea in quel momento, Green e colleghi hanno creato le basi per la clonazione di cellule staminali umane adulte nei campi della biologia di base e della medicina rigenerativa.
In questo articolo di revisione, forniamo una panoramica dei recenti progressi della ricerca e accumulando prove di un sistema di coltura cellulare che ha portato a scoperte tecniche nelle tecnologie delle cellule epiteliali. Nuove strategie di coltura sia per le cellule epiteliali stratificate che per le cellule epiteliali colonnari hanno permesso di ricapitolare lo sviluppo epiteliale umano e possono essere utilizzate per generare un modello di malattia umana in vitro. Discutiamo anche il potenziale e le possibili applicazioni delle normali tecnologie di coltura cellulare epiteliale per la medicina rigenerativa e mettiamo in evidenza un sistema di coltura cellulare tumorale che riproduce i fenotipi dei singoli pazienti.
Coltura cellulare epiteliale stratificata
Nei tessuti epiteliali stratificati, incluso l’epitelio ghiandolare e pseudostratificato, le cellule p63+, localizzate sulla membrana basale, possono auto-rinnovarsi per mantenere le popolazioni staminali/progenitrici e dare origine a progenie che formano tessuti funzionali . Come accennato in precedenza, la clonazione e l’espansione delle cellule staminali epiteliali, come i cheratinociti cutanei e le cellule epiteliali corneali, sono state ben consolidate nei sistemi di co-coltura con fibroblasti di topo 3T3-J2 irradiati. Tuttavia, questo protocollo standard è stato in gran parte limitato alla coltura a lungo termine di cheratinociti e cellule corneali. Tuttavia, sono state riportate cellule staminali clonate da epiteli timici, così come l’isolamento di cellule staminali epiteliali timiche da diverse specie, comprese le cellule umane, coltivate con un sistema di alimentazione 3T3 . Inoltre, Frey e colleghi hanno recentemente applicato il metodo 3T3 feeder per isolare le cellule staminali uroteliali che esprimevano sonic hedgehog e risiedevano nello strato basale dell’urotelio della vescica . Queste cellule staminali uroteliali da tessuto umano e suino isolato sono state coltivate stabilmente su uno strato di alimentazione 3T3 e sono state in grado di dare origine a più lignaggi cellulari, incluse le cellule basali p63+ e le cellule uroteliali Uroplakin 2+ e 3+, dopo trapianto di capsule renali in topi nudi. Nel 2011, Pooja et al. sfruttato il sistema di coltura 3T3 per isolare tre tipi di cellule staminali epiteliali delle vie aeree umane, cioè, nasali, tracheali e distali cellule staminali delle vie aeree, e ha scoperto che queste cellule staminali epiteliali delle vie aeree esibivano fenotipi cellulari distinti dopo differenziazione in vitro, anche se i cloni di cellule staminali immature sembravano essere morfologicamente indistinguibili (Fig. 1) . In uno studio di follow-up, il trapianto di cellule staminali epiteliali tracheali e distali di topo ha dimostrato che le cellule staminali distali delle vie aeree sono state prontamente incorporate nel tessuto polmonare danneggiato dall’influenza H1N1 e differenziate in più tipi di cellule epiteliali, cioè, bronchioli e alveoli, mentre le cellule staminali tracheali trapiantate erano localizzate solo nelle principali vie aeree . Le cellule staminali clonogeniche sono state anche isolate da campioni di biopsia endoscopica dell’esofago umano e queste cellule sono state in grado di formare strutture epiteliali squamose ben differenziate e stratificate in un sistema di coltura air Liquid Interface (ALI).
Schema del processo di coltura cellulare per cellule staminali epiteliali umane stratificate e colonnari su uno strato di alimentatore di topo 3T3. Per le cellule staminali epiteliali stratificate, sono isolate dalla biopsia o i campioni chirurgici sono placcati su uno strato 3T3 per una coltura a lungo termine. Per le cellule staminali epiteliali colonnari, sono placcate su uno strato 3T3 con fattori definiti che sono essenziali per la crescita e il mantenimento delle cellule staminali. Le colonie morfologicamente immature (colonie imballate con piccole cellule) di cellule staminali epiteliali vengono raccolte meccanicamente per un’ulteriore espansione omogenea. ALI cultura, le cellule subiscono differenziazione in tipi di cellule mature in Transwell
Schlegel e colleghi hanno riferito che un polo fieristico di Rho-associated protein chinasi (ROCK), un inibitore in combinazione con 3T3 cellule di alimentatore aumentato significativamente la capacità proliferativa delle cellule staminali epiteliali, tra cheratinociti umani, le cellule della prostata e della ghiandola mammaria cellule, e l’hanno chiamato questo fenomeno condizionale “riprogrammazione” . La capacità di generare in modo efficiente colture di cellule staminali epiteliali da pazienti fornisce informazioni critiche e preziose sulla diagnostica e sulla terapia cellulare . Più recentemente, Rajagopal e colleghi hanno dimostrato che la via di segnalazione TGFß/BMP/SMAD è importante in vari tessuti epiteliali, tra cui la pelle derivata dall’ectoderma e il tessuto della ghiandola mammaria, l’esofago derivato dall’endoderma e il tessuto prostatico e l’epididimo derivato dal mesoderma. Hanno scoperto che la doppia inibizione della segnalazione SMAD (il segnale BMP è stato bloccato da DMH-1 e il segnale TGFß è stato inibito da A-83-01) ha facilitato la propagazione stabile delle popolazioni di cellule basali epiteliali umane e murine. Sorprendentemente, la doppia inibizione TGFß / BMP ha permesso la robusta espansione delle cellule staminali epiteliali senza la necessità di cellule di alimentazione del mouse 3T3.
Collettivamente, questi progressi tecnici, in combinazione con piccole molecole e cellule feeder, possono essere utilizzati per espandere in modo continuo ed efficiente le popolazioni staminali epiteliali stratificate/progenitrici in vitro. Un’altra svolta nella cultura epiteliale stratificata, la cultura organoide, è stata utilizzata per espandere sia i progenitori della prostata umana basale che luminale. Questi progenitori luminali umani erano multipotenti e formavano strutture simili a ghiandole prostatiche in vitro . Tuttavia, la generazione di strutture tridimensionali costituite da epiteli stratificati o pseudostratificati per ricapitolare l’autentica architettura in vivo rimane impegnativa, sebbene molti ricercatori abbiano riportato culture sferoidi e organoidi. Questo problema può essere risolto stabilendo un metodo per facilitare l’auto-organizzazione, come eseguito nei tessuti derivati dalle cellule staminali pluripotenti .
Coltura cellulare epiteliale colonnare
Sebbene le cellule staminali intestinali posseggano la notevole capacità di proliferare ad un alto tasso di turnover per mantenere gli epiteli intestinali e gli epatociti siano altamente rigenerativi in risposta ai danni, la capacità di clonare le popolazioni di cellule staminali dalle cellule epiteliali colonnari è severamente limitata, presumibilmente a causa della mancanza di segnali di nicchia Negli ultimi dieci anni, Clevers e colleghi hanno scoperto LGR5 (rich leucine repeat-containing G-protein coupled receptor 5), un marker di cellule staminali intestinali, in un sofisticato modello murino (i topi Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 incrociati con il reporter LACZ Rosa26 attivato da Cre) e hanno stabilito un metodo di coltura organoide intestinale del topo costituito da strutture simili a villi e zone simili a cripta con In combinazione con fattori di crescita e cocktail a piccole molecole, una frazione di cellule staminali LGR5+ isolata è stata sospesa in Matrigel e coltivata a lungo termine . Modificando la condizione della coltura con l’uso di nicotinamide, un inibitore del recettore p38 e TGFß, le cellule epiteliali umane isolate dall’intestino tenue e dal colon sono state in grado di espandersi infinitamente a lungo termine in vitro . Questa tecnica è applicabile alla coltura di altri tipi di cellule , come le cellule del dotto pancreatico e gli epatociti, e ha facilitato i progressi rivoluzionari nella coltura cellulare epiteliale colonnare.
La coltura organoide impiega una piattaforma di coltura 3D basata su Matrigel e può essere ampiamente utilizzata per coltivare stabilmente diversi tipi di cellule epiteliali adulte, comprese le cellule epiteliali stratificate, con popolazioni di cellule staminali/progenitrici . Tuttavia, la capacità di propagare rapidamente ed efficacemente una frazione di cellule staminali uniformi in vitro è anche utile e importante per lo studio dettagliato dell’auto-rinnovamento e della specifica del destino nelle cellule staminali tissutali e possibili future applicazioni del trapianto di cellule per la medicina rigenerativa. Xian e colleghi hanno recentemente sviluppato un nuovo sistema di coltura per l’espansione omogenea delle cellule staminali intestinali fetali umane, comprese le cellule dell’intestino tenue e del colon. Questo sistema ha impiegato uno strato di alimentatore per topi 3T3 in combinazione con fattori di crescita e inibitori della via del segnale per espandere in modo robusto le cellule staminali epiteliali colonnari umane (Fig. 1) . Inoltre, più del 50% delle cellule staminali intestinali coltivate su fibroblasti 3T3 sono stati in grado di formare colonie. Nell’intestino dei mammiferi, fattori di nicchia definiti, come i segnali Wnt e Notch, sono essenziali per governare la staminali delle cellule staminali intestinali alla base della cripta. Inoltre, le cellule di Paneth, che si trovano anche alla base della cripta, derivano dalle cellule staminali e fungono da nicchia delle cellule staminali fornendo fattori essenziali in modo paracrino. Poiché le colture organoidi sono costituite da cellule staminali e vari derivati, come le cellule di Paneth, i fattori di nicchia vengono forniti autonomamente . Al contrario, poiché una popolazione pura di cellule staminali intestinali viene coltivata su uno strato di alimentatore 3T3, le cellule non possono secernere fattori di nicchia. Pertanto, i fattori estrinseci che assomigliano a fattori di nicchia devono essere integrati. Oltre al protocollo di mantenimento delle cellule staminali, è stato stabilito un protocollo di differenziazione in un modello di coltura ALI per dare origine ad almeno quattro tipi di cellule intestinali principali, cioè cellule di Paneth, cellule entero-endocrine, cellule caliciformi e enterociti (cellule assorbenti intestinali) . La formazione di strutture simili a villi intestinali è stata osservata in base ai tipi di tessuto originali, come i tessuti dell’intestino tenue e del colon (Fig. 1). In un diverso approccio alla cultura ALI, Kuo e colleghi hanno coltivato in modo robusto piccoli pezzi di intestino neonatale di topo con un elemento stromale a lungo termine .
La stessa strategia è stata applicata anche per clonare cellule staminali gastriche umane ottenute da biopsia endoscopica. In particolare, le cellule gastriche clonogeniche sono state stabilmente espanse su uno strato di alimentatore 3T3 in combinazione con fattori di crescita e piccole molecole e differenziate in lignaggi epiteliali gastrici tipicamente presenti nello stomaco, come le cellule principali che esprimono pepsinogeno . Oltre alle cellule staminali dell’organo digestivo clonato, le cellule progenitrici dell’ovidotto dal tubo distale dell’utero erano anche in grado di propagarsi all’infinito su uno strato di alimentatore 3T3 in presenza di fattori di nicchia . L’ovidotto distale, l’epitelio di fimbria, è un semplice strato di epitelio colonnare costituito dai seguenti due tipi di cellule: cellule ciliate, che migliorano il trasporto di gameti e cellule secretorie, che secernono muco. Utilizzando una leggera modifica del protocollo di differenziazione per le cellule staminali intestinali, le cellule staminali oviduttali ALI-coltivate a lungo termine hanno dato origine a un’architettura 3D, contenente sia cellule ciliate che secretorie, che ricordava la struttura dell’epitelio in vivo . La capacità di produrre lignaggi epiteliali con tipi di cellule appropriati da una popolazione di cellule staminali potrebbe essere uno strumento utile per studiare lo sviluppo epiteliale fisiologico e l’omeostasi e sviluppare modelli di malattie acute e croniche in vitro.
Coltura di cellule tumorali
Poiché la prima linea di cellule tumorali, la linea cellulare HeLa, è stata stabilita da un paziente affetto da cancro cervicale nel 1951 , le linee di cellule tumorali stabilite da un’ampia varietà di tipi di cancro sono state ampiamente utilizzate per studiare la patobiologia del cancro e hanno fornito opportunità per generare modelli di xenotrapianto in vivo e testare farmaci Sebbene siano stati fatti enormi progressi nella biologia del cancro utilizzando linee cellulari tumorali, i risultati ottenuti utilizzando queste cellule potrebbero non riflettere sufficientemente la complessità della malattia come originariamente previsto perché il cancro presenta eterogeneità interpaziente e intratumorale, come rivelato dai recenti progressi nel sequenziamento di nuova generazione . Per riflettere con maggiore precisione i fenotipi del cancro, inclusi lo stato e la patologia della mutazione genetica del paziente, Welm e colleghi hanno sviluppato modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) di cancro al seno in topi con immunodeficienza combinata grave diabetica nonobese (NOD-SCID) che hanno mantenuto le caratteristiche essenziali dei tumori originali e hanno mostrato capacità metastatica in siti specifici . Oltre al modello di cancro al seno, l’istituzione di vari tipi di tumori solidi ha dimostrato la fattibilità dei modelli PDX , che sono previsti per accelerare i test preclinici di nuove terapie oncologiche e aiutare a realizzare l’obiettivo della “medicina personalizzata”.
I metodi di coltura per le cellule staminali adulte, come i sistemi organoidi e di alimentazione, sono applicabili anche a diversi approcci che utilizzano cellule tumorali derivate dal paziente. In particolare, Clevers e colleghi hanno riferito che la cultura organoide può essere utilizzata per modellare il pancreas , la prostata e il cancro del colon-retto e hanno dimostrato che i tratti originali del cancro , tra cui l’eterogeneità genetica e la sensibilità ai farmaci, possono essere ricapitolati. Pertanto, hanno definito questo sistema una “biobanca organoide vivente”. Queste tecnologie potrebbero anche essere utilizzate per isolare una popolazione di cellule staminali da una lesione precancerosa, come l’esofago di Barrett, un precursore dell’adenocarcinoma esofageo umano . Le cellule staminali isolate ed espanse dell’esofago di Barrett sono state trasformate introducendo l’antigene SV40 large T, hTERT e c-myc e xenografted in topi NSG immunocompromessi (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). Come previsto, le cellule staminali dell’esofago di Barrett si sono trasformate in tumori esofagei simili all’adenocarcinoma nei topi. Un approccio simile ha dimostrato che le cellule staminali oviduttali umane erano la cellula di origine nel cancro epiteliale ovarico sieroso di alto grado . Questa scoperta corrobora la recente patologia umana e l’evidenza del modello murino transgenico, che indicava che l’epitelio oviduttale distale è il tessuto di origine di questo cancro . In combinazione con il sistema CRISPR/Cas9, le normali cellule staminali del colon sono state trasformate in sequenza introducendo le mutazioni del driver che sono frequentemente rilevate nel cancro del colon-retto . Le cellule risultanti sono state autorizzate a formare xenotrapianti nella capsula renale e hanno mostrato una progressiva trasformazione in fenotipi simili ad adenocarcinoma caratterizzati da proprietà invasive e metastatiche. Nel complesso, la capacità di isolare e coltivare cellule da tessuti epiteliali normali abbinati al tumore e al paziente facilita la produzione di una piattaforma che non solo integra il classico lavoro animale in vivo nel campo della biologia del cancro, ma facilita anche approcci genetici e genomici specifici del paziente in vitro.
Modellare la malattia infiammatoria con cellule staminali adulte
Modellare la malattia umana è ostacolato dalla limitata accessibilità dei tessuti umani malati. Tuttavia, i progressi nella coltivazione di cellule staminali adulte ci hanno permesso di riprodurre fenotipi di malattia in vitro espandendo le cellule staminali e derivando tipi di cellule mature da piccoli campioni bioptici umani. Poiché i metodi di coltura 3D, come la cultura ALI e organoide, forniscono strutture costituite da più tipi di cellule e assomigliano all’architettura dell’epitelio osservata in vivo, dovrebbero essere adatti per lo studio di malattie infiammatorie, comprese le malattie infettive ed ereditarie. In particolare, riprodurre il fenotipo della malattia è semplice quando sono noti l’agente patogeno (o la causa principale) e il tipo di cellula mirata.
La colite pseudomembranosa (PMC) è causata da una popolazione sproporzionatamente aumentata di Clostridium difficile (C. difficile) dopo il trattamento con antibiotici. C. difficile è un batterio gram-positivo che forma spore e produce le tossine ad alto peso molecolare TcdA e TcdB, che inducono la secrezione fluida, l’infiammazione ed il danno del tessuto del colon. Le cellule epiteliali del colon differenziate dalle cellule staminali del colon clonogeniche nella coltura di ALI sono state sfidate con queste tossine, che hanno causato danni epiteliali devastanti in modo dipendente dal tempo e dalla dose. Questo risultato ha indicato che il modello di coltura 3D può essere utilizzato per rappresentare la patologia C. difficile . Allo stesso modo, l’effetto dell’infezione da Helicobacter pylori (H. pylori), che causa gastrite cronica, ulcere gastriche e cancro, è stato studiato mediante microiniezione di H. pylori in colture organoidi. Le colture organoidi infette da batteri hanno mostrato un aumento dell’infiammazione, come l’attivazione di NF-kB e l’induzione di IL8, e l’espressione di IL8 era significativamente più alta nelle colture organoidi di tipo ghiandola rispetto alle colture organoidi di tipo pit .
Le cellule staminali adulte sono state utilizzate anche per modellare la malattia ereditaria. Beekman e colleghi hanno riportato una coltura organoide intestinale derivata da pazienti affetti da fibrosi cistica (CF). La CF è causata da mutazioni nel regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR), che è normalmente espresso nelle cellule epiteliali di molti organi, come i tessuti polmonari e digestivi. Sebbene le normali colture organoidi intestinali mostrassero un gonfiore robusto in risposta alla forskolina, la risposta al gonfiore non è stata osservata nelle colture organoidi CF . Inoltre, quando il locus CFTR mutato è stato corretto utilizzando la tecnologia CRISPR / Cas9 in organoidi intestinali di pazienti CF, i geni corretti hanno dimostrato di funzionare funzionalmente . Pertanto, la differenziazione in vitro delle cellule staminali adulte, simile a fenotipi in vivo con più tipi di cellule in combinazione con tecnologie di editing genico, fornisce potenti mezzi per il trattamento delle malattie umane e può fornire una visione diretta della patologia umana.
Applicazione di cellule staminali epiteliali per la medicina rigenerativa
Nonostante promettenti strategie che utilizzano staminali embrionali umane (ES) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule per applicazioni in medicina rigenerativa, pochi studi clinici di queste strategie sono in corso, che è in parte dovuto alle difficoltà specifica del lignaggio e la possibilità di tumorigenesi. Poiché le cellule staminali adulte sono essenzialmente impegnate in specifici tipi di tessuto, produrre tipi di cellule destinati è relativamente facile e il rischio potenziale di tumorigenesi è basso. Pertanto, gli approcci terapeutici mirano a utilizzare le cellule staminali adulte come fonte di cellule per il trapianto. Sebbene Green e colleghi abbiano stabilito il metodo di coltura dei cheratinociti umani nel 1975 e le cellule coltivate fossero trapiantabili in pazienti con ustioni o lesioni chimiche, la coltivazione a lungo termine di altri tipi di cellule staminali adulte era soggetta a notevoli barriere tecniche. Come descritto sopra, i recenti progressi tecnici hanno superato questa limitazione per diversi tipi di cellule epiteliali. Quindi, la capacità di espandere rapidamente ed efficientemente le popolazioni di cellule staminali è preziosa per il loro uso nella medicina rigenerativa.
Ad esempio, le cellule staminali del colon del topo Lgr5+ sono state espanse in coltura organoide e trapiantate nel colon del topo danneggiato, e le cellule attecchite che erano in grado di auto-rinnovarsi e differenziarsi sono state rilevate anche dopo 25 settimane . Con un approccio diverso, Zhang K e colleghi hanno sfruttato le cellule staminali adulte ingegnerizzate per uno studio sui trapianti. In primo luogo, hanno coltivato con successo le cellule epiteliali corneali in un piatto senza cellule di alimentazione e poi hanno scoperto che Pax6 è un fattore di trascrizione chiave che differenzia le cellule staminali corneali (CSCs) dai cheratinociti cutanei. Sorprendentemente, la sovraespressione di Pax6 nei cheratinociti ha indotto cellule staminali limbari simili a cellule e queste cellule potrebbero essere trapiantate nelle cornee ferite dei conigli . Poiché i cheratinociti sono più facilmente accessibili rispetto ai CSC, questo metodo può essere applicabile per il trattamento della malattia dell’occhio umano. Più recentemente, Liu et al. riportato un approccio attraente per la riparazione e la rigenerazione dei tessuti che ha utilizzato cellule staminali endogene. Nel loro studio, le cellule staminali epiteliali lente (LEC) che esprimevano Pax6 e Bmi1 sono state caratterizzate e hanno mostrato un potenziale rigenerativo in vivo. È stato impiegato un metodo di rimozione chirurgica della cataratta che preserva i LEC endogeni e questi LEC hanno contribuito alla rigenerazione spontanea delle lenti con funzione visiva in conigli, macachi e neonati umani. Questo metodo potrebbe essere una svolta terapeutica per il trattamento della cataratta e potenzialmente sostituire l’impianto di lenti intraoculari artificiali .
A causa degli alti tassi di turnover di molte cellule epiteliali, il trapianto di popolazioni di cellule staminali è essenziale per il mantenimento a lungo termine dei tessuti. Teoricamente, una singola cellula staminale può ricostituire interi tessuti e diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato empiricamente questa nozione . Nonostante il potenziale delle cellule staminali pluripotenti (PSC), che possono dare origine a tutti i tipi di cellule, le cellule staminali tissutali derivate da PSC probabilmente non possono essere mantenute allo stato immaturo in vitro. Pertanto, l’uso di cellule staminali adulte per la medicina rigenerativa presenta un vantaggio significativo.