Delezione interstiziale di 5q22.2q23. 1 Inclusi APC e TSSK1B in un paziente con poliposi adenomatosa e Astenoteratozoospermia

Abstract

Le delezioni interstiziali 5q22 sono relativamente rare e solitamente rappresentate da gravi caratteristiche cliniche come ritardo dello sviluppo e ritardo della crescita. Qui, riportiamo un paziente maschio di 23 anni, riferito al nostro laboratorio per la conferma genetica di una possibile poliposi adenomatosa familiare. MLPA e la successiva matrice CGH hanno identificato una cancellazione di circa 8 Mb nel locus 5q22.2q23. 1. Ulteriori analisi della regione eliminata e dei geni all’interno hanno suggerito un possibile ruolo per il gene TSSK1B (serina/treonina chinasi 1 testis-specific) nella capacità riproduttiva del paziente. L’analisi dello sperma ha confermato che la capacità riproduttiva del paziente era compromessa e che soffriva di astenoteratozoospermia. L’analisi della regione del fattore azoospermia sul cromosoma Y non ha rivelato microdelezioni. Ulteriori test di sequenziamento non sono riusciti a trovare una spiegazione alternativa per l’infertilità del paziente. Questo caso dimostra un possibile ruolo di TSSK1B nella riproduzione maschile.

© 2018 S. Karger AG, Basel

Fatti accertati

• Le eliminazioni interstiziali di 5q22 sono rare e tipicamente accompagnate da complicanze neurologiche e dello sviluppo.

Novel Insights

• Presentiamo un caso con una delezione eterozigote nel locus 5q22.2q23.1 che non presenta i problemi di sviluppo che tipicamente derivano da questo tipo di delezione.

• Il gene TSSK1B all’interno di questo locus è stato recentemente testato funzionalmente in organismi modello; qui possiamo vedere il primo rapporto di aploinsufficienza di questo gene potenzialmente causando un fenotipo umano.

• TSSK1B può essere una causa putativa per l’infertilità maschile.

Le eliminazioni interstiziali di 5q22q23 sono relativamente rare e di solito accompagnate da gravi caratteristiche cliniche come ritardo dello sviluppo, ritardo della crescita e caratteristiche dismorfiche . Le eliminazioni in questa regione coinvolgono spesso il gene soppressore del tumore APC (OMIM 611731) e portano alla poliposi adenomatosa familiare (FAP). La FAP è una condizione autosomica dominante ereditaria che porta a polipi intestinali multipli e predisposizione al cancro del colon. Sebbene la prima delezione interstiziale 5q riportata fosse nel 1979, il locus APC è stato scoperto in seguito da Kinzler et al. , chi l’ha mappato al 5q22.2 banda. A causa della tempistica di questa scoperta, tutti i casi clinici di 5q delezioni fino a quel momento non hanno esaminato la manifestazione di FAP nel paziente, e quindi non contribuiscono alcuna informazione sul legame tra 5q22 delezioni e FAP. I pazienti con delezioni cromosomiche che includono APC sono più spesso diagnosticati quando le loro caratteristiche dismorfiche sono rivelate nell’infanzia o quando non riescono a prosperare e mostrano altri segni di sviluppo ritardato ; quelli che rimangono asintomatici di solito sperimentano manifestazioni gastrointestinali come perdita di peso, rectorhaggia e ostruzione intestinale.

A causa della completa caratterizzazione delle basi molecolari per la FAP e della gravità dei suoi sintomi patologici, l’attenzione clinica è più spesso concentrata sul gene APC stesso o sulle conseguenze fisiche di una grande delezione cromosomica, rivelando poche o nessuna informazione sulla funzione di altri geni nella banda 5q22.2. Sebbene siano state descritte numerose aberrazioni cromosomiche, l’analisi delle conseguenze tende a concentrarsi sulle caratteristiche dismorfiche risultanti o sul FAP senza impartire la funzione a singoli geni. Grandi delezioni all’interno del cromosoma stesso presentano un fenotipo complesso, combinando diverse caratteristiche cliniche da quelle sopra menzionate e possono essere una sfida per il clinico diagnostico.

Case Report e metodi

Il paziente è un uomo bulgaro di 23 anni senza precedenti clinici. Alla sua prima ammissione, si lamentava di frequente rectorhaggia senza anomalie nella frequenza di defecazione o perdita di appetito. Una sigmoidoscopia è stata eseguita con risultati che puntano verso FAP, per il quale è stato indirizzato a un reparto gastroenterologico specializzato per ulteriori test. La storia familiare non era disponibile a causa di motivi etici, poiché il paziente era stato in una famiglia affidataria sin dalla tenera età e non c’era alcun contatto con i suoi genitori biologici. La fibrocolonoscopia ha rivelato un gran numero di polipi nel retto e nel sigma-da pallido a rosso scuro-con iperplasia (Fig. 1 BIS). Non ci sono state lesioni FAP-associate al di fuori del tratto gastrointestinale. A questo punto, il paziente è stato indirizzato al nostro laboratorio genetico per confermare la diagnosi FAP.

Il DNA genomico è stato isolato dal sangue periferico utilizzando protocolli standard ed è stato utilizzato per schermare il gene APC per eliminazioni e duplicazioni più grandi utilizzando MLPA. Il kit MLPA APC è stato ottenuto da MRC-Holland (PO43, Amsterdam, Paesi Bassi) e l’analisi è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore.

Per determinare i confini della delezione, il DNA genomico è stato analizzato da array CGH su un array oligonucleotidico 1M ad alta risoluzione secondo il protocollo del produttore (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Il rilevamento della variazione del numero di copia (CNV) è stato condotto utilizzando il software CytoGenomics (versione 2.9.2.4, Agilent Technologies). Sono state utilizzate le seguenti impostazioni di analisi: algoritmo di aberrazione ADM-2, soglia: 6.0, dimensione della finestra: 0.5 Mb, filtro: 5 sonde, e log2 rapporto = 0.29.

L’eiaculato è stato staccato in laboratorio e studiato nell’ordine: osservazione della preparazione nativa, determinazione della concentrazione spermatica, valutazione dei tamponi per la vitalità nella mobilità < 40% e valutazione della morfologia dello sperma secondo i criteri di ESHRE/NAFA, utilizzando Sperm Class Analyzer (SCA), un sistema di analisi quantitativa e qualitativa dei parametri dello sperma umano.

I test molecolari per le microdelezioni nella regione del fattore azoospermia sono stati eseguiti come descritto nelle linee guida e negli standard dell’Accademia europea di Andrologia .

Il sequenziamento Sanger è stato eseguito per esaminare le regioni precedentemente segnalate associate all’infertilità maschile, ad esempio DAZL (OMIM 601486), SEPT12 (OMIM 611562), SLC26A8 (OMIM 608480), SYCE1 (OMIM 611486) e successivamente TSSK1B (OMIM 610709).

Risultati

Abbiamo riscontrato una diminuzione dell’area di picco del 50% in tutte le sonde genetiche APC specifiche da MLPA. Poiché ciò corrispondeva a una delezione eterozigote dell’intera sequenza genica APC, il nostro passo successivo è stato quello di eseguire un array CGH per determinare i confini della delezione. I risultati ottenuti hanno mostrato che la delezione interstiziale nel cromosoma 5q era limitata alla regione 5q22.2q23. 1, lunga circa 8 Mb (Fig. 2 BIS). La delezione si estende nella regione tra coppie di basi chr5: 111,779,298-119,794,955(GRCh37/hg19), cariotipo: arr 5q22.2q23.1 (111779298_119794955)×1 , confermando la delezione APC e coinvolgendo altri 29 geni codificanti proteine nella delezione. Insieme ai geni APC e MCC ben descritti, un altro gene, TSSK1B, era stato precedentemente studiato e attribuito con una funzione specifica. TSSK1B è altamente espresso nel testicolo e richiesto durante lo sviluppo dello spermatide . Pertanto, abbiamo deciso di eseguire un’analisi dello sperma e testare il nostro paziente per infertilità, numero di spermatozoi, morfologia e motilità.

La valutazione finale ha concluso che il paziente soffriva di astenoteratozoospermia con prevalenza di difetti cefalici, morfologia spermatica atipica del 97% e ridotta motilità spermatica (Fig. 2 QUATER). Il valore dell’indice di teratozoospermia a 1,71 mostra più di 1 difetto per singolo sperma, indicando una spermatogenesi compromessa. Poiché questo fenotipo è più spesso causato da microdelezioni nella regione del fattore azoospermia e grandi delezioni cromosomiche all’interno del cromosoma Y non sono state mostrate sull’array CGH, abbiamo eseguito test molecolari per possibili microdelezioni nel cromosoma Y. La nostra analisi non ha rivelato alcuna eliminazione all’interno dei marcatori del fattore azoospermia sY84, sY86, sY127, sY134, sY254 e sY255. I test per le mutazioni più comuni nei geni associati all’infertilità maschile come DAZL, SEPT12, SLC26A8 e SYCE1 non hanno rivelato alterazioni. Infine, il sequenziamento del gene TSSK1B non ha rivelato anomalie all’interno della singola copia presente.

Questi risultati hanno ridotto la possibilità che TSSK1B sia un forte gene candidato per l’infertilità maschile ed è coinvolto nel fenotipo astenoteratozoospermia del nostro paziente.

Discussione

Eliminazioni cromosomiche della banda 5q22 con conseguente FAP sono state raramente riportate in tutta la letteratura. I rapporti esistenti hanno lo scopo di confrontare e contrastare le eliminazioni tra diversi casi di pazienti; tuttavia, le implicazioni patologiche di tali eliminazioni non sono state studiate in dettaglio oltre la diagnosi clinica iniziale . La dimensione della regione cancellata interstiziale 5q varia notevolmente tra i pazienti, che vanno da 1,7 Mbp a 20 Mbp e più grandi, con la maggior parte dei casi che presentano vari gradi di difficoltà di apprendimento, incapacità di prosperare e segni dismorfici minori o maggiori . Questi sintomi non sono limitati a una singola banda cromosomica (Fig. 2B), che ha impedito la classificazione dei sottotipi di cancellazione 5q, sebbene siano stati fatti diversi tentativi . I risultati notevoli di questi studi mostrano una mancanza di una correlazione genotipo-fenotipo nei casi che condividono una regione interessata e nessuna associazione tra la dimensione della delezione e la gravità del fenotipo.

Per quanto ne sappiamo, l’ultima revisione dei geni e delle loro funzioni all’interno di questa regione è stata condotta da Ofner et al. . Finora, solo 4 geni (APC, MCC, TRIM36 e HSD17B4) situati all’interno della regione eliminata nel nostro paziente sono stati associati a una malattia in OMIM, sebbene la ricerca sia in corso. Inoltre, lo stato di fertilità della maggior parte dei pazienti con una delezione 5q non è mai stato pubblicato a causa della loro età precoce e la loro condizione non è mai stata seguita oltre la diagnosi iniziale. Nei rapporti precedentemente pubblicati di eliminazioni 5q, solo un singolo caso ha documentato una possibile eredità di una delezione TSSK1B da un sospetto portatore maschio; tuttavia, il padre del paziente non ha potuto essere testato per confermare che la delezione è stata ereditata. Per quanto riguarda TSSK1B che comprende CNV nella popolazione normale, c’è solo una singola voce DGV di una perdita di copia (nsv599396, dimensione totale del campione 17,421; PMID 21841781) .

Nel paziente qui presentato, non abbiamo osservato gravi sintomi patologici che sono esposti in tipici casi di delezione 5q22 oltre al FAP. Ciò può essere spiegato dalla possibilità che la delezione che presentiamo non si sovrapponga completamente con le delezioni in pazienti con gravi problemi dismorfici / di sviluppo (Fig. 2 TER). Mentre il fenotipo clinico comune per i pazienti con delezioni nel braccio lungo del cromosoma 5 copre una vasta gamma di caratteristiche come ritardo dello sviluppo, incapacità di prosperare, ritardo psicomotorio, ponte nasale piatto e altri, il fenotipo presentato dal nostro paziente è rappresentato quasi esclusivamente dalla delezione eterozigote del gene APC e dalla conseguente diagnosi FAP.

Il background genetico dei fattori di infertilità testicolare, in particolare l’astenozoospermia, è stato a lungo limitato e scarsamente descritto. La maggior parte dei fattori di infertilità testicolare e il loro background genetico sono stati collegati a geni residenti nel cromosoma Y e aberrazioni cromosomiche che coinvolgono il cromosoma Y. Ci sono stati progressi nel campo, come recenti ricerche hanno mirato a mettere in relazione fenotipi dismorfologia dello sperma a geni specifici, come DAZL, SYCE1, SLC26A8, SEPT12, e altri che hanno una funzione legata alla spermatogenesi . Anche così, il campo della genetica dell’infertilità maschile è ancora relativamente nuovo e nuovi contributi sono cruciali per il miglioramento continuo dei test genetici, della diagnosi e della consulenza .

La serina/treonina chinasi testicolo-specifica 1 è un gene intronless, parte della famiglia TSSK e un ramo della superfamiglia serina/treonina chinasi. È stato identificato per la prima volta da Bielke et al. , che nel loro studio ha attribuito al gene un frame di lettura aperto di 1092 bp che codifica per una proteina 364-aa. Il TSSK1B umano è stato studiato utilizzando macchie settentrionali e puntiformi, che hanno mostrato una somiglianza dell ‘ 85% con il Tssk1b murino.Il gene è stato mappato sul cromosoma 5q22, in una regione che non mostra synteny al locus cromosomico del topo di Tssk1b . Ulteriori studi hanno evidenziato che l’espressione specifica di Tssk1b è localizzata quasi esclusivamente nei testicoli, il che implicava una funzione legata alla riproduzione e alla spermatogenesi . Studi di espressione temporale hanno ulteriormente dimostrato che Tssk1b è espresso esclusivamente nelle ultime fasi della maturazione degli spermatozoi . La funzione di Tssk1b è stata confermata in vivo da Xu et al. utilizzando topi chimerici per determinare se una cancellazione mirata in Tssk1b e Tssk2 può essere trasmessa nella linea germinale. I loro esperimenti hanno dimostrato che i topi chimerici producevano solo prole di tipo selvaggio, anche se le cellule spermatiche contenevano sia l’allele di tipo selvaggio che quello mutato. Un ulteriore esame del testicolo e dell’epididimo nella chimera ha mostrato che solo un basso numero di spermatozoi poteva raggiungere la maturazione . Nel loro studio, Xu et al. suggerito che l’infertilità è causata da aploinsufficienza. Sebbene l’esatto meccanismo della manifestazione patologica non sia stato studiato, le implicazioni funzionali di una delezione di allele in questo gene sembrerebbero provocare una morfologia dello sperma alterata. Nell’uomo, una microdelezione che comprende TSSK1B può quindi costituire un fattore di rischio per l’infertilità maschile.

Finora, TSSK1B è stato studiato esclusivamente in modelli animali e le implicazioni funzionali non sono state esplorate negli esseri umani. Qui, presentiamo quello che consideriamo il primo caso di correlazione tra una copia cancellata di TSSK1B e astenozoospermia, probabilmente confermando il legame tra gene e funzione in vivo.

Conclusione

Questo è uno dei pochi casi che descrivono un giovane adulto con una grande delezione interstiziale nel cromosoma 5, con sintomi che si manifestano in un’età in cui il paziente può essere testato per la fertilità. Per quanto ne sappiamo, nessun paziente con delezioni nella banda 5q22.2 è stato esaminato per l’infertilità e solo un caso di una possibile eredità non confermata di una delezione TSSK1B da un portatore maschile è stato osservato. Anche le alterazioni dello sviluppo più lievi osservate oltre al fenotipo FAP dovrebbero portare a ulteriori indagini su questa regione cromosomica oltre il gene APC, utilizzando i metodi sopra elencati per definire eventuali alterazioni cromosomiche. Vorremmo anche incoraggiare l’ulteriore studio del ruolo di TSSK1B nella riproduzione maschile e della sua parte nel causare astenozoospermia.

Inoltre, dimostriamo l’utilità di MLPA e array CGH nella pratica clinica. MLPA potrebbe essere considerato come l’analisi di prima linea, e se viene trovata una delezione dell’intero gene bersaglio, i risultati potrebbero essere confermati e i punti di interruzione localizzati da array CGH.

Riconoscimento

Siamo grati alla famiglia che ha fornito le informazioni cliniche e ha dato il permesso di pubblicarle.

Dichiarazione di etica

Il paziente ha firmato moduli di consenso informato per test genetici e fotografia medica. Gli autori non hanno conflitti etici da rivelare.

Informativa

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

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