ELISA: Come Analizzare i Risultati Sperimentali

Da Dr. Surat P, Ph. D. Recensito da Dr. Tomislav Meštrović, MD, Ph. D.

ELISA, o Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, è uno strumento utilizzato per rilevare e quantificare le sostanze, come peptidi, proteine, anticorpi e ormoni. Comporta l’immobilizzazione di un antigene o anticorpo su una superficie, seguita dall’aggiunta di un campione da analizzare. Il rilevamento dipende da una specifica reazione antigene-anticorpo.

Jarun Ontakrai |

Cosa fare prima di eseguire un test ELISA

Un test ELISA deve essere sempre effettuato in replica (duplica o triplica) per ottenere un numero sufficiente di campioni per calcolare la deviazione standard e coefficiente di variazione. Il coefficiente di errore deve essere mantenuto inferiore al 20%. Se l’errore calcolato è elevato, devono essere valutati gli errori dovuti a pipettaggio, contaminazione di piastre e reagenti, evaporazione e/o temperatura.

Curva standard

Per misurare la concentrazione del campione viene utilizzata una curva standard. Innanzitutto, vengono tracciati i valori di assorbanza delle concentrazioni standard (pg/ml). Viene eseguita anche una curva negativa che non contiene dati campione standard e viene utilizzata per rilevare e misurare il rumore di fondo. Per una misurazione accurata, questo valore di sfondo deve essere sottratto dalla curva standard.

I valori di assorbanza della concentrazione nota possono essere tracciati come controllo positivo. La concentrazione della proteina bersaglio viene ottenuta calcolando prima l’assorbanza media e quindi utilizzando la curva standard per stimare la concentrazione.

Devono essere presi in considerazione anche i fattori di diluizione. Ad esempio, se il campione è stato diluito quattro volte, l’assorbanza deve essere moltiplicata per quattro prima di utilizzare la curva standard per ricavare la concentrazione.

Coefficiente di variazione

La definizione di coefficiente di variazione è il rapporto tra deviazione standard e media – cioè deviazione standard (σ)/media (µ). Valori elevati di coefficiente di variazione indicano imprecisioni dovute a pipettaggio o miscelazione di reagenti tra pozzetti, contaminazione batterica o fungina, essiccazione di pozzetti o variazioni di temperatura.

Spike recovery

Il valore ottenuto dopo aver eseguito il test ELISA dipende da come una proteina mirata interagisce con gli anticorpi e questa interazione viene confrontata con una curva proteica standard. Diversi fattori – tra cui buffer, matrice e anticorpi eterofili-possono influenzare il legame del campione, quindi questo deve essere preso in considerazione quando si determina l’accuratezza di un ELISA.

È possibile eseguire un test spike per determinare l’accuratezza dei risultati ELISA. In questo test, una quantità nota di proteina ricombinante viene aggiunta o aggiunta al campione. Quindi, utilizzando la curva standard viene misurata la quantità di materiale. Grandi deviazioni nei valori misurati possono indicare errori dovuti a elementi sconosciuti nel test.

Test di linearità

Il test di linearità viene anche utilizzato per determinare l’accuratezza di ELISA. In questo caso, il “campione a spillo” viene diluito in serie a 1:2, 1:4 e 1:8. Se viene rilevata la concentrazione del campione alterato e se i risultati non mostrano una variazione lineare delle misurazioni, potrebbe indicare errori nell’accuratezza di ELISA.

In alcuni casi, errori possono essere osservati a determinate concentrazioni e non più osservati a concentrazioni più basse. In tali casi, può essere necessario diluire il campione prima di eseguire le misurazioni della concentrazione.

Risoluzione dei problemi

il rumore di fondo può essere causato da una serie di fattori, tra cui:

• Insufficiente il lavaggio dei pozzetti
• Contaminati buffer di lavaggio
• Troppo reagente di rilevamento
• Cross-reattività degli anticorpi
• Precipitazione del buffer e/o analita

a Volte, poveri curva standard può essere generato. Ciò può essere dovuto a errori nella soluzione standard, alla degradazione dello standard, alla ricostituzione non corretta dello standard o se la curva non si adatta alla scala. Considerando quest’ultimo, il plotting può essere eseguito utilizzando diverse scale, come log-log o 5 parameter logistic curve.

bibliografia

• Tutti Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Contenuto
• ELISA Applicazioni
• Western Blot – Laboratorio di Tecnica Utilizzata per la rilevazione di Proteine
• Anticorpo Applicazioni
• Espressione Genica di Misura

Scritto da

Dr. Surat P

Dr. Surat laureato con un Ph. D. in Biologia Cellulare e Meccanobiologia dal Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) nel 2016. Prima del suo dottorato, Surat ha studiato per un Bachelor of Science (B.Sc.) laurea in Zoologia, durante la quale è stata destinataria di una borsa estiva dell’Accademia Indiana delle Scienze per studiare le proteine coinvolte nell’AIDs. Produce articoli su una vasta gamma di argomenti, come l’etica medica, la manipolazione dei dati, la pseudoscienza e la superstizione, l’educazione e l’evoluzione umana. È appassionata di comunicazione scientifica e scrive articoli che coprono tutte le aree delle scienze della vita.

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