la Relazione tra il periodo di tempo dopo la vasectomia e la capacità riproduttiva di spermatozoi ottenuti da parte dell’epididimo aspirazione

Abstract

PREMESSA: non è ben definito se il tempo trascorso dopo la vasectomia ha alcuna influenza sul risultato della FIVET–ICSI utilizzando spermatozoi dell’epididimo. Abbiamo analizzato retrospettivamente i risultati di 151 cicli ICSI in cui gli spermatozoi di uomini vasectomizzati sono stati utilizzati in diversi periodi di tempo dopo la vasectomia. METODI: Gli ovociti sono stati ottenuti dopo un protocollo di stimolazione ovarica desensibilizzante utilizzando agonista GnRH in associazione con FSH ricombinante e HCG. Lo sperma è stato recuperato mediante aspirazione percutanea dello sperma epididimale. I cicli sono stati suddivisi in tre gruppi: ≤10 anni dopo la vasectomia (gruppo 1, n = 47), 11-19 anni dopo la vasectomia (gruppo 2, n = 79) e ≥20 anni dopo la vasectomia (gruppo 3, n = 25). RISULTATO: Come prevedibile, l’età media degli uomini differiva nei tre gruppi (gruppo 3 > gruppo 2 > gruppo 1), e l’età media delle donne era anche significativamente più alta nel gruppo 3 che nei gruppi 1 e 2, sebbene non siano state descritte differenze tra i gruppi 2 e 3. Tutti gli altri parametri clinici e di laboratorio erano simili nei tre gruppi. I tassi di gravidanza in corso e di impianto (34, 25, 8% e 22, 15, 6% rispettivamente) sono diminuiti significativamente dal gruppo 1 al gruppo 3. CONCLUSIONE: I tassi di gravidanza e impianto dopo ICSI con sperma da uomini vasectomizzati sono negativamente correlati con l’intervallo di tempo dalla vasectomia, che non può essere spiegato esclusivamente dall’invecchiamento maschile o femminile.

Introduzione

ICSI è una tecnica di trattamento di riproduzione assistita di successo che è stata sviluppata originariamente per alleviare l’infertilità maschile (Palermo et al., 1992; Van Steirteghem et al., 1993). I risultati ottenuti con lo sperma eiaculato sembrano non essere correlati alla concentrazione o alla morfologia dello sperma (Nagy et al., 1995a; Svalander et al., 1996). La prognosi è compromessa solo nei casi in cui non si trovano spermatozoi mobili (Nagy et al., 1995a).

L’aspirazione dello sperma epididimale e testicolare viene abitualmente utilizzata per ottenere spermatozoi nei casi di azoospermia ostruttiva e non ostruttiva. I tassi di fecondazione sono simili in questi casi a quelli ottenuti con lo sperma dall’eiaculato (Nagy et al., 1995b; Van Steirteghem et al., 1998). ICSI, quindi, è diventato un’alternativa efficace per ripristinare la fertilità nei casi post vasectomia in cui una reanastomosi ha fallito o l’intervallo di tempo dalla vasectomia ha portato a siti secondari di ostruzione epididimale. Inoltre, ICSI può eliminare gli effetti negativi sulla fertilità degli anticorpi anti-sperma frequentemente presenti in questi uomini (Heidenreich et al., 1994). Nella maggior parte dei casi ostruttivi, compresi gli uomini post-vasectomizzati, l’aspirazione dello sperma epididimale è il metodo di scelta per ottenere lo sperma (Craft et al., 1995). L’aspirazione con ago sottile, come tecnica, è una procedura più semplice e meno invasiva rispetto all’intervento microchirurgico sugli epididimi o sui testicoli (Tournaye et al., 1998).

Rapporti recenti suggeriscono che la fertilità maschile diminuisce con l’età (Auroux, 1993). Tuttavia, è stato precedentemente pubblicato che negli uomini sani normali, la qualità dello sperma di per sé non diminuisce significativamente con il tempo (Fisch et al., 1996). Inoltre, l’esito dell’ICSI sembra non essere correlato all’età paterna (Spandorfer et al., 1998).

D’altra parte, gli effetti negativi legati al tempo sulla qualità e sulla fertilità dello sperma sono stati descritti nei maschi post-vasectomizzati (Urry et al., 1990). È stata riportata una maggiore incidenza di anticorpi anti-sperma e aggregazione di spermatozoi insieme a una diminuzione della percentuale di spermatozoi mobili (Weiske, 2001).

A causa dei suddetti benefici di ICSI rispetto alla reanastomosi, una percentuale significativa di pazienti azoospermici ostruttivi che cercano un trattamento da parte di ICSI sono uomini vasectomizzati. Poiché al momento non è noto se il periodo post-vasectomia abbia alcuna influenza sull’esito dell’ICSI–IVF, abbiamo analizzato la relazione tra il periodo di tempo post-vasectomia e la capacità riproduttiva dello sperma dopo l’ICSI.

Materiali e metodi

Abbiamo analizzato retrospettivamente i risultati di 151 cicli ICSI, eseguiti a causa di azoospermia ostruttiva post-vasectomia, completati nel periodo da giugno 1998 a giugno 2000. I pazienti sono stati assegnati a tre gruppi in base al periodo di tempo post-vasectomia. L’intervallo dalla vasectomia è stato arrotondato all’anno completato più vicino dalla data della vasectomia al tempo dell’ICSI. Tutti i casi sono stati indirizzati al nostro centro perché hanno scelto l’ICSI rispetto alla reanastomosi della VAS come forma primaria di terapia. Tutti i casi sono stati sottoposti ad aspirazione percutanea dello sperma epididimale (PESA) come tecnica per ottenere lo sperma. Il gruppo 1 consisteva in 47 cicli in cui il periodo di tempo dalla vasectomia era ≤10 anni; il gruppo 2 ha coinvolto 79 cicli in cui il periodo di tempo dalla vasectomia era compreso tra 11 e 19 anni e il gruppo 3 comprendeva 25 cicli in cui il periodo di tempo dalla vasectomia era ≥20 anni.

La stimolazione ovarica è stata eseguita utilizzando una combinazione di un agonista del GnRH (leuprolide acetate, Lupron®; Abbott Laboratórios do Brasil Ltda, São Paulo, Brasile), protocollo lungo e FSH ricombinante (Gonal-F®; Serono Laboratorios, São Paulo, Brasile). Lo sviluppo follicolare è stato monitorato con misurazioni periodiche dell’estradiolo sierico e dell’ecografia vaginale. HCG 10 000 UI (Profasi®; Serono Laboratorios) è stato somministrato quando almeno due follicoli hanno raggiunto un diametro medio di 18 mm e il recupero degli ovociti è stato eseguito mediante aspirazione transvaginale guidata da ultrasuoni 34 h più tardi.

Epididimo sperma aspirazione

Sperma sono stati recuperati da PESA. Un ago calibro 27,5 è stato introdotto nella parte prossimale dell’epididimo (di solito situato nel polo superiore del testicolo) e una delicata aspirazione è stata eseguita con una siringa da 1 ml (B-D; Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda, Curitiba, Brasile). L’aspirato è stato inserito in una capsula di Petri ed è stato lavato con mezzo IVF-50 (IVF Science Scandinavian, Gothenburg, Svezia). Il campione è stato valutato per la presenza di spermatozoi mobili. Se nel campione non era presente sperma mobile, l’aspirazione epididimale è stata ripetuta.

Procedure di laboratorio di embriologia

Gli ovociti raccolti in liquido follicolare puro sono stati immediatamente inviati al laboratorio di embriologia adiacente, dove sono stati identificati utilizzando un microscopio da dissezione a ingrandimento ×50. Dopo essere stati identificati, gli ovociti sono stati collocati in un singolo piatto di coltura del pozzo (3260; Costar, Cambridge, MA, USA) con 1,0 ml di 80 UI/ml di ialuronidasi (Hyase-1; FIV Science Scandinavian) per 30 s e successivamente sono stati lavati più volte in mezzo IVF-50. Ogni ovocita è stato posto separatamente all’interno di una goccia di 30 µl di mezzo IVF-50 e coperto con olio minerale leggero (Ovoil 150; IVF Science Scandinavian) e incubato per 2-4 h a 37°C in un’atmosfera con 5% CO2. Alla fine del periodo di incubazione, le cellule cumulus e corona radiata sono state rimosse con una pipetta di plastica del diametro di 135 µm, collegata a uno stripper cellulare (Mid Atlantic Diagnostics Inc., Medford, NJ, Stati Uniti d’America).

La maturità nucleare e la qualità ooplasmatica sono state valutate utilizzando un microscopio a luce invertita (Nikon Diaphot Microscope®; Nikon Corporation, Tokyo, Giappone) ad ingrandimento ×200 o ×400. Gli ovociti di metafase-II (MII) sono stati microiniettati entro un periodo di 2-4 ore dopo la raccolta. Ovociti di metafase I (MI) sono stati osservati per l’estrusione del primo corpo polare a intervalli di 4 ore fino a 8 ore dopo il recupero e l’iniezione è stata eseguita di conseguenza. I metodi per l’iniezione di sperma sono stati precedentemente riportati (Abdelmassih et al., 1996).

Dopo l’iniezione di sperma, gli ovociti sono stati incubati in 1 ml di mezzo IVF-50, coperto con olio minerale, per 16-18 h. Gli ovociti sono stati osservati 16-18 h dopo ICSI per la presenza o l’assenza di pronuclei e corpi polari (Nagy et al., 1998a). La fecondazione era considerata normale quando erano presenti due pronuclei chiaramente distinti. Se è stato osservato un singolo pronucleo, una seconda valutazione è stata effettuata circa 4 h più tardi. Quando è stata rilevata la presenza di tre pronuclei, l’ovocita è stato scartato.

Gli ovociti contenenti due pronuclei sono stati coltivati separatamente in goccioline di 30 µl di mezzo IVF-50 ricoperte di olio minerale in una capsula di Petri (3260; Costar) e sono stati conservati fino al trasferimento. Gli embrioni sono stati osservati a 42 h (giorno 2) e a 68 h (giorno 3) dopo l’iniezione e classificati secondo i criteri proposti da Staessen (Staessen et al., 1989). In base al numero di blastomeri e alla proporzione relativa di frammenti anucleati presenti nella zona pellucida, gli embrioni sono stati classificati in una delle quattro categorie: 1, eccellente (tipo A), quando non anucleate frammento era presente (6 – 8-fase di cellule in giornata 3); 2, buona (tipo B), quando <20% dell’embrione è stato frammentato (da 6 a 8 celle stadio il giorno 3 o <6 celle senza frammentazione); 3, fiera (tipo C), quando il relativo importo di frammenti tra il 20 e il 50%; 4, poveri (tipo D), quando >50% dell’embrione è stato frammentato. Gli embrioni con frammentazione >50% non sono stati trasferiti.

Al momento del trasferimento, gli embrioni sono stati caricati in 15 µl di mezzo IVF-50 utilizzando un catetere Edwards Wallace di 23 cm (Simcare Manufacturing Ltd, Hythe, Kent, UK).

La fase luteale è stata supportata dalla somministrazione giornaliera di 800 mg di progesterone vaginale (Utrogestan®; Laboratoires Besins-Isvovesco, Parigi, Francia) e cerotti transdermici 100 µg di estradiolo cambiati giornalmente (Estraderm TTS100®; Biogalênica Laboratório, São Paulo, Brasile). I livelli sierici di β-HCG sono stati misurati 12 giorni dopo il trasferimento dell’embrione.

L’ecografia transvaginale è stata eseguita in tutti i pazienti con titoli β-HCG ascendenti; sono stati valutati la presenza e il numero di sacche gestazionali intrauterine, nonché la presenza di un polo fetale e l’attività cardiaca. La gravidanza è stata monitorata dall’ostetrico del paziente e l’esito finale è stato segnalato alla clinica sia dall’ostetrico che dal paziente.

Analisi statistica

L’analisi a senso unico della varianza (ANOVA) e i test di Kruskal–Wallis sono stati utilizzati per confrontare i mezzi di età femminile e maschile, il tasso di fecondazione, la qualità dell’embrione, il numero di embrioni trasferiti e il periodo di tempo dopo la vasectomia. L’analisi della tabella di contingenza e i test esatti di Fisher sono stati utilizzati per confrontare i tassi di gravidanza, impianto e aborto.

Risultati

I risultati più importanti dei 151 cicli inclusi nello studio sono presentati nella Tabella I. L’età media degli uomini è aumentata dal gruppo 1 a 3 e la differenza tra ciascun gruppo è statisticamente significativa (P < 0,0001). L’età media delle donne era significativamente più bassa nel gruppo 1 rispetto ai gruppi 2 e 3, ma non diversa nel gruppo 2 rispetto al gruppo 3 (Tabella I).

Il numero medio di ovociti recuperati e iniettati e i tassi di fecondazione erano simili in tutti e tre i gruppi. Anche la qualità degli embrioni e il numero di embrioni trasferiti erano simili nei tre gruppi (Tabella I).

Il tasso di gravidanza clinica e il tasso di gravidanza in corso erano correlati significativamente con il periodo di tempo della vasectomia (P < 0,05; χ2 test per la tendenza), e il periodo più lungo di vasectomia era associato a un minor numero di gravidanze (Tabella I). Anche il tasso di impianto è diminuito dal gruppo 1 a 3 e la differenza tra tutti i gruppi è stata statisticamente significativa (P < 0,05, analisi della tabella di contingenza e test esatto di Fisher). Il tasso di aborto ha mostrato una tendenza ad aumentare dal gruppo 1 a 3, ma non ha raggiunto la significatività statistica tra i gruppi.

Al fine di escludere l’effetto dell’età femminile sui risultati, abbiamo analizzato i dati di 84 dei 151 cicli in cui sono state incluse solo le donne che avevano ≤35 anni. I risultati, organizzati nello stesso modo in tre gruppi, sono presentati nella Tabella II. La differenza nell’età media maschile dei tre gruppi è rimasta significativa (P < 0,0001) ma l’età femminile non differiva significativamente tra i tre gruppi. Anche il numero di ovociti iniettati e fecondati era simile nei tre gruppi, così come il numero e la qualità degli embrioni trasferiti ai pazienti. I tassi di gravidanza in corso e di impianto sono stati significativamente più alti nei gruppi 1 e 2 rispetto al gruppo 3 (Tabella II).

Discussione

I nostri dati confermano che l’aspirazione percutanea dello sperma epididimale combinata con ICSI è un’opzione di trattamento di successo per l’alleviamento dell’infertilità post-vasectomia. La tecnica del prelievo dello sperma è semplice, eseguita con anestesia locale e può essere ripetuta senza danni evidenti all’epididimo.

È importante sottolineare che i risultati del nostro studio suggeriscono, per la prima volta, una correlazione negativa tra l’esito della gravidanza della fecondazione assistita e l’intervallo di tempo dalla vasectomia al trattamento. La differenza nei tassi di gravidanza e impianto persisteva dopo che i risultati erano stati corretti per l’età delle donne. Le uniche differenze cliniche evidenti rimaste erano l’età media dei maschi tra i gruppi e il periodo di tempo della vasectomia. L’influenza dell’età maschile sui risultati della riproduzione assistita non è ben determinata. Alcuni studi suggeriscono un declino del potenziale di fertilità con l’avanzare dell’età maschile (Auroux, 1993), tuttavia la maggior parte degli studi non ha stabilito una correlazione tra l’invecchiamento e il potenziale riproduttivo degli uomini (Krause e Habermann, 2000). Anche il follow-up individuale fino a 25 anni non ha rivelato cambiamenti importanti (Fisch et al., 1996). Ancora più importante per quanto riguarda il nostro studio, i risultati ICSI per diverse categorie diagnostiche non sono influenzati dall’età del partner maschile (Spandorfer et al., 1998) in contrasto con l’importante ruolo dell’età del partner femminile (Abdelmassih et al., 1996; Devroey et al., 1996).

Il tasso di successo dell’inversione della vasectomia nel ripristino della fertilità è una relazione inversa con l’intervallo di tempo dalla vasectomia (Belker et al., 1991). Fino ad ora, gli effetti negativi legati al tempo della vasectomia in relazione alla fertilità erano assegnati a fattori meccanici (la crescente incidenza di siti secondari di ostruzione epididimale) che rendevano più difficile il restauro anatomico e alla comparsa di titoli significativi di anticorpi anti-sperma (Heidenreich et al., 1996). L’ICSI supera ovviamente il blocco meccanico e i risultati ottenuti con la tecnica sono indipendenti da fattori immunologici (Nagy et al., 1995c).

Tutti i casi inclusi nel nostro studio sono stati sottoposti ad aspirazione dello sperma epididimale. Silber et al. hanno suggerito che nei casi di epididimo cronicamente ostruito, gli spermatozoi subiscono cambiamenti legati alla senescenza con una significativa diminuzione della motilità verso la porzione distale (Silber et al., 1995). D’altra parte, Moore ha riferito che in questi casi un numero sproporzionato di spermatozoi morti o morenti si trova anche nella porzione prossimale (Moore, 1998). L’autore suggerisce che in condizioni normali, il liquido epididimale protegge lo sperma vitale dagli enzimi acrosomiali liberati dallo sperma nel processo di degenerazione. La stagnazione secondaria all’ostruzione cronica interferirebbe con questo meccanismo protettivo. Inoltre, è stato dimostrato che negli uomini con azoospermia ostruttiva, il DNA dello sperma testicolare è significativamente meno danneggiato del DNA dello sperma epididimale prossimale (Steele et al., 1999). Nello stesso studio gli autori hanno scoperto che la qualità del DNA nello sperma ottenuto dal testicolo è la stessa di quella trovata negli uomini normali, suggerendo che il danno trovato nello sperma epididimale viene acquisito con il tempo dopo essere stato prodotto. Si è tentati di ipotizzare che il danno al DNA dello sperma epididimo aumenti con il tempo di ostruzione e, nei casi presentati qui, il tempo dalla vasectomia. Nella stessa linea di pensiero, l’uso di immotile (a causa della necrozoospermia) sperma eiaculato o epididimale per ICSI era associato a una fecondazione molto scarsa e allo sviluppo embrionale; tuttavia, lo sperma testicolare (dello stesso paziente), anche se immotile, ha fornito un risultato molto migliore del ciclo di trattamento (Nagy et al., 1995a; Tournaye et al., 1996; Nagy et al., 1998b).

In questo studio, non sono state osservate differenze significative nel tasso di fecondazione e nella qualità degli embrioni trasferiti a 72 h post-fecondazione tra i tre gruppi. Gli effetti dell’uso di spermatozoi danneggiati molecolarmente sulla fecondazione potrebbero essere mascherati con l’uso di ICSI e le prime fasi dello sviluppo embrionale dipendono principalmente dalle informazioni materne poiché il genoma embrionale viene attivato dopo lo stadio a 8 cellule (Braude et al., 1988). Tuttavia, l’aumento del danno al DNA dello sperma epididimale (utilizzato esclusivamente nei casi riportati) potrebbe costituire una spiegazione per i tassi di impianto dell’embrione più bassi e per i tassi più elevati di aborto riscontrati nei casi con un periodo più lungo dalla vasectomia.

I nostri risultati differiscono dai dati riportati da altri (Sukharoen et al., 2000) ma non può essere in diretta contraddizione. Il numero di casi inclusi nel nostro studio era significativamente più grande e i dati precedentemente riportati includevano alcuni casi in cui l’ICSI veniva eseguito con sperma ottenuto dai testicoli.

I risultati riportati qui possono avere importanti implicazioni cliniche. L’aspirazione epididimale percutanea dello sperma è una procedura semplice, veloce e popolare per ottenere lo sperma dagli uomini con azoospermia ostruttiva; tuttavia, alla luce del presente studio, l’aspirazione con ago sottile dai testicoli può rappresentare un approccio migliore, specialmente in quei casi con un tempo prolungato di ostruzione. Tuttavia, un’ulteriore raccolta e analisi dei dati ottenuti da studi prospettici dovrebbero essere eseguite al fine di stabilire l’intervento migliore in questi casi.