Braz J Med Biol Res, Maggio 2004, Volume 37(5) 625-634
L’uso di trascrizione inversa-PCR per la diagnosi di X-linked malattia granulomatosa cronica
P. Agudelo-Flórez1, J. A. López1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 e A. Condino-Neto1
1Centro de Investigação em Pediatria, e i Reparti di Pediatria e di Farmacologia, Facoltà di Scienze Mediche, Università Statale di Campinas, Campinas, SP, Brasile
2Departamento di Immunologia, Istituto di Scienze Biomediche, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasile.
3Disciplina di Allergia, Immunologia e Reumatologia, Dipartimento di Pediatria, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brasile.
4Laboratório Medical Research 56, Dipartimento di Dermatologia, Facoltà di Medicina,, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Abstract Introduzione Pazienti e Metodi Risultati Discussione Ringraziamenti Corrispondenza e Note a piè di pagina
Abstract 
malattia granulomatosa Cronica (CGD) è una malattia ereditaria del sistema immunitario innato, caratterizzata da un difetto di burst ossidativo dei fagociti e conseguente compromissione della loro attività microbicida. Le mutazioni in uno dei componenti della NADPH-ossidasi influenzano l’espressione genica o la funzione di questo sistema, portando al fenotipo di CGD. Difetti nel gp91-phox portano a CGD X-linked, responsabile di circa il 70% dei casi di CGD. Lo studio del genotipo altamente eterogeneo dei pazienti CGD include analisi di mutazione, analisi Northern blot o Western blot in base al caso particolare. Lo scopo del presente studio era quello di utilizzare la trascrizione inversa (RT)-PCR per l’analisi dei difetti molecolari responsabili della CGD X-linked in otto pazienti brasiliani e di valutare il suo potenziale per una più ampia applicazione allo screening molecolare nella CGD. L’RNA totale è stato preparato da linfociti B trasformati dal virus Epstein B e trascritto inverso utilizzando esameri casuali. Il cDNA risultante è stato PCR-amplificato da coppie specifiche e sovrapposte di primer progettati per amplificare tre regioni del gene gp91-phox: esoni 1-5, 3-9 e 7-13. Questa strategia ha rilevato un’espressione gp91-phox difettosa in sette pazienti. I risultati della RT-PCR hanno confrontato la storia clinica, i dati biochimici (nitroblue tetrazolium o superoxide release assay) e l’analisi delle mutazioni disponibili in quattro casi. In tre casi supplementari, i risultati di RT-PCR hanno abbinato la storia clinica ed i dati biochimici. In un altro caso, la RT-PCR era normale nonostante una storia clinica compatibile con CGD e scoppio respiratorio difettoso. Concludiamo che questa nuova applicazione dell’analisi RT-PCR – un metodo semplice, economico e rapido-era appropriata per lo screening dei difetti molecolari in 7 su 8 pazienti con CGD X-linked.
Parole chiave: Superossido, fagociti, immunodeficienza primaria, Scoppio respiratorio, neutrofili, Umano
Introduzione
La malattia granulomatosa cronica (CGD) è un’immunodeficienza primaria originariamente descritta nel 1957 come entità clinica che colpisce i neonati maschi e denominata, all’epoca, malattia granulomatosa fatale dell’infanzia. Le caratteristiche principali della CGD sono infezioni ricorrenti e gravi che coinvolgono le barriere naturali dell’organismo come le vie respiratorie e i linfonodi e, infine, le strutture interne come fegato, milza, ossa e cervello (1-3). L’incidenza stimata di questa malattia rara è di 1/250.000 nati vivi all’anno. Le infezioni sono generalmente causate da batteri catalasi-negativi come Staphylococcus aureus, bacilli Gram-negativi e specie fungine come Aspergillus, Candida e Nocardia (4,5).
Il sistema della NADPH-ossidasi genera il superossido ed altri mediatori reattivi dell’ossigeno, cruciali per l’attività microbicida dei fagociti. Il difetto biochimico della CGD è una compromissione dell’attività della NADPH-ossidasi e la successiva incapacità di distruggere i microrganismi (6). I componenti principali del sistema NADPH-ossidasi sono gp91-, p22-, p47-, p67-e p40-phox. I difetti molecolari che causano CGD sono generalmente dovuti all’assenza, alla bassa espressione o al malfunzionamento di uno dei componenti della NADPH-ossidasi. La forma X-linked di questa malattia è causata da difetti in gp91-phox, la catena pesante del citocromo b588, e rappresenta circa il 70% di tutti i casi (7,8). Le forme autosomiche recessive sono causate da difetti in uno dei componenti citosolici della NADPH ossidasi (p47 – o p67-phox, rispettivamente nel 20 e 5% dei casi), o il componente della catena leggera del citocromo b588 (p22-phox, 5% dei casi) (9,10). La CGD è una condizione altamente eterogenea: oltre 300 mutazioni sono state registrate in un database X-CGD mantenuto a livello internazionale (8). Le mutazioni sono state distribuite in gran parte all’interno dei 13 esoni o ai confini esone/introne del gene gp91-phox (CYBB) e quasi 200 di queste mutazioni sono uniche.
La diagnosi di CGD è generalmente basata sulle caratteristiche cliniche della malattia più l’attività difettosa della NADPH-ossidasi come dimostrato dai test anormali del nitroblue tetrazolium (NBT), dihydrorhodamine 123 o superoxide release (11,12). Nel test NBT stimolato, gli individui normali mostrano quasi il 100% di cellule positive, mentre nei pazienti con CGD meno del 5% delle cellule sono positive (13). Inoltre, le cellule di pazienti con CGD variante sono positive, ma mostrano solo un’attività molto bassa (6). Il test NBT rileva anche i portatori di CGD X-linked (madri e sorelle). Una diagnosi definitiva di CGD molecolare è stabilita in pazienti con un test NBT anormale o un’attività respiratoria burst che hanno una delle seguenti caratteristiche: una mutazione in gp91-, p22-, p47-, o p67-phox; mRNA assente per uno di questi geni rilevati dall’analisi Northern blot; e/o proteina assente per uno di questi componenti ossidasi da Western blot. Una diagnosi genetica, ma non molecolare, può essere stabilita dalla dimostrazione di cugini materni, zii o nipoti con un test NBT anormale o scoppio respiratorio (14). Pertanto, l’istituzione di una diagnosi definitiva di questa malattia rara e altamente eterogenea richiede metodologie complesse e costose come una combinazione di Northern blot o Western blot e analisi del polimorfismo di conformazione a singolo filamento (SSCP) seguita dal sequenziamento del DNA di diversi membri della famiglia, tutti eseguiti in laboratori di ricerca ad alta complessità.
Il metodo reverse transcription-PCR (RT-PCR) prevede l’amplificazione del cDNA mediante PCR. Questa tecnica può essere facilmente standardizzata in laboratori meno sofisticati. Fornisce informazioni sull’espressione genica e dati preliminari sulla struttura o sulle dimensioni dell’mRNA del componente difettoso. La RT-PCR è stata raramente utilizzata nella ricerca CGD, essendo limitata agli studi di fisiopatologia (15-29). Ad oggi, il potenziale utilizzo di questo utile strumento per stabilire la diagnosi definitiva di CGD X-linked, la forma più frequente, non è stato ampiamente studiato. Lo scopo del presente studio era quello di valutare l’uso di RT-PCR per lo screening dei difetti molecolari responsabili della CGD X-linked, un’immunodeficienza rara e possibilmente mal diagnosticata, in otto pazienti brasiliani.
Pazienti e metodi
Pazienti
Lo studio ha incluso 8 pazienti brasiliani maschi non correlati con probabile CGD legata all’X (2 neri e 6 caucasici; età 2-8 anni; altezza 88-108 cm; peso 11-19 kg). I pazienti hanno presentato storie cliniche di infezioni gravi ricorrenti come polmonite, linfoadenite, ascesso epatico, piodermite e reazioni avverse all’immunizzazione BCG. Sono stati indirizzati al nostro laboratorio per la valutazione diagnostica biochimica e molecolare. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai partecipanti prima dello studio. Il Comitato Etico della Scuola Medica ha approvato il protocollo in conformità alla Convenzione di Helsinki e al Ministero della Salute del Brasile, Risoluzione 196/96.
Diagnosi biochimica di CGD
La diagnosi biochimica di CGD è stata stabilita secondo i criteri del Gruppo panamericano per le immunodeficienze. Una compromissione dell’attività della NADPH-ossidasi è stata dimostrata dal test di scorrimento NBT e/o dal test di rilascio di anioni superossido da parte dei neutrofili del sangue periferico e dei leucociti mononucleati (14,30,31). Neutrofili e leucociti mononucleati sono stati ottenuti mediante centrifugazione di campioni di sangue su un gradiente di densità Ficoll-Hypaque (32).
Il test su vetrini NBT si basava sulla riduzione di NBT a formazan da parte dei leucociti attivati (31). Il test è stato eseguito come descritto in precedenza (30). Più del 95% dei 200 neutrofili normali stimolati con 30 nM di fluorbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) dovrebbe essere in grado di ridurre l’NBT. La reazione assente o le cellule positive <5% è stata considerata per indicare una diagnosi di CGD (14).
Il rilascio quantitativo di superossido da parte dei neutrofili e dei leucociti mononucleati è stato valutato mediante un test di riduzione del citocromo c inibibile con superossido dismutasi modificato (33-35). La quantità di superossido rilasciata è stata calcolata utilizzando un coefficiente di estinzione di 0,21 nM/cm per il citocromo c. I risultati sono riportati come superossido di nmol rilasciato da 106 cellule all’ora. I pazienti con CGD hanno mostrato meno del 10% dei valori di controllo.
Screening dei difetti molecolari responsabili della CGD legata all’X
I linfociti B di pazienti con CGD legata all’X sono stati trasformati in vitro con il virus Epstein B (EBV) (15,16) al fine di fornire un’abbondante fonte di acidi nucleici per gli studi molecolari. Le linee cellulari B trasformate da EBV riproducono i difetti biochimici e molecolari dei pazienti CGD (15,16,36) ed eliminano la necessità di ripetute raccolte di sangue. In breve, i leucociti del sangue periferico di pazienti con CGD X-linked sono stati coltivati con surnatanti da B95-8, una linea cellulare produttrice di EBV (15,16,36,37), in un mezzo RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale inattivato dal calore (10%), 2 mm di L-glutammina, 100 U/ml di penicillina e 100 µg/ml di streptomicina, a 37ºC, in atmosfera umida con 5% di CO2. La vitalità cellulare è stata monitorata e le colture sono state mantenute per tutto il periodo dello studio.
Campioni di RNA provenienti da linee di cellule B trasformate da EBV sono stati preparati con il metodo della guanidina HCl, seguito da precipitazione e quantificazione di etanolo con metodi standard (38,39). I campioni di cDNA sono stati ottenuti mediante trascrizione inversa di 2 µg di RNA totale con APICE II RT (GIBCO BRL) e esameri casuali (15). La qualità dei campioni di mRNA è stata controllata mediante amplificazione PCR di ß-actina, un controllo genetico costitutivo (bp 920-943 e bp 1494-1471) (Gen Bank accession No. NM001101).
l’espressione genica gp91-phox è stata valutata mediante RT-PCR. Coppie specifiche e sovrapposte di primer (Gen Bank accession No. NM_000397, Tabella 1) sono stati utilizzati per amplificare (30 cicli) tre regioni esoniche gp91-phox: 1-5, 3-9 e 7-13. Questa strategia ci ha permesso di esaminare tutti gli esoni gp91-phox. I prodotti PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2% e colorati con bromuro di etidio.
L’espressione genica relativa gp91-phox è stata analizzata con il software Image Master (Pharmacia-Biotech). Il risultato della densitometria per i campioni bersaglio è stato diviso per il risultato della densitometria di ß-actina, un controllo genetico costitutivo, normalizzando il livello considerato per l’analisi. I risultati dei test RT-PCR sono stati confrontati con l’anamnesi clinica del paziente, i test biochimici (NBT e/o superoxide release assay) e i dati di analisi delle mutazioni disponibili (indicehttp://www.sbi.org.br/Sbi2003/.htm).
Risultati
Abbiamo studiato 8 pazienti maschi con storie cliniche di infezioni gravi ricorrenti, riferiti al nostro laboratorio per la diagnosi biochimica e molecolare di CGD. I risultati dei test sui vetrini NBT e dei test di rilascio del superossido sono riportati nella Tabella 2. Sei dei pazienti hanno presentato meno del 5% di leucociti positivi nel test di scorrimento NBT. Sei pazienti hanno mostrato una compromissione del rilascio di superossido da parte di granulociti e / o leucociti mononucleati (meno del 10% rispetto ai controlli sani). Quattro pazienti hanno avuto risultati anomali in entrambi i test. Tutti i pazienti hanno presentato almeno un test anomalo e hanno ricevuto la diagnosi di probabile CGD legata all’X. La madre e la sorella del paziente T. B. P. hanno presentato un test di diapositive NBT compatibile con lo stato del vettore di CGD X-linked. Durante il periodo di studio un paziente (G. M.) è morto di polmonite.
Abbiamo poi studiato la diagnosi definitiva di CGD X-linked mediante analisi RT-PCR dell’espressione genica gp91-phox. I risultati dell’amplificazione RT-PCR con tre serie di primer sovrapposti sono presentati nella Tabella 2. La qualità del campione di mRNA è stata controllata mediante amplificazione PCR di ß-actina, un controllo genetico costitutivo. In questo caso sono stati ottenuti i prodotti normali previsti (figure 1, 2 e 3).
In quattro casi, è stato possibile abbinare i dati RT-PCR con l’analisi delle mutazioni disponibili, presentata altrove da Patiño et al. (30) o dal nostro gruppo ( //www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. ha presentato una transizione C469®T nell’esone 5, prevedendo una mutazione nonsense (R157X). M. F. ha presentato una sostituzione senza senso in exon 3, R (arginina) 73-Stop. R. S. ha mostrato una sostituzione 264 G®A alla giunzione di giunzione 3 ‘ di gp91-phox exon 3. La sequenza cDNA ha mostrato una delezione di gp91-phox esone 3, dando origine a un mutante instabile o non funzionale gp91-phox. G. G. presentato uno splicing difettoso di gp91-phox esone 3 (la mutazione sottostante non è stata ancora determinata). Gli altri pazienti continuano ad essere sotto inchiesta.
Nel suo complesso, questa strategia ha permesso di rilevare l’espressione difettosa di gp91-phox in sette pazienti su otto. I risultati di RT-PCR hanno confrontato la storia clinica, i dati biochimici (saggio di rilascio di NBT o superossido) e l’analisi di mutazione disponibile in quattro casi. In tre casi supplementari, i risultati di RT-PCR hanno abbinato la storia clinica ed i dati biochimici. In un altro caso, RT-PCR era normale nonostante una storia clinica compatibile con CGD, uno scoppio respiratorio difettoso caratterizzato dal test NBT e dal test di rilascio del superossido e dai test NBT della madre e della sorella compatibili con lo stato del vettore CGD X-linked.
Discussione
Questo articolo riporta gli studi biochimici e di espressione genica di 8 pazienti maschi brasiliani non correlati con una storia clinica di CGD, che sono stati indirizzati al nostro laboratorio per indagini dettagliate. CGD è una rara malattia ereditaria in cui le cellule fagocitiche non sono in grado di generare anione superossido e altri intermedi reattivi di ossigeno. Inizialmente abbiamo stabilito la diagnosi di CGD X-linked probabile per mezzo di metodi biochimici come i test di scorrimento NBT e / o test di rilascio di anioni superossido. I nostri risultati hanno mostrato che tutti i pazienti presentavano una compromissione della funzione NADPH-ossidasi e, a sua volta, una probabile CGD legata all’X.
Entrambi i metodi contribuiscono alla probabile diagnosi di CGD in modi diversi. Il test di scorrimento NBT fornisce informazioni sul numero di cellule che riducono NBT a formazan all’interno del citoplasma e sull’intensità di questa riduzione. Pertanto, i pazienti con forme varianti di CGD X-linked mostrano test di diapositive NBT anormali, in cui la maggior parte delle cellule riduce debolmente NBT a formazan. Il test di diapositive NBT rileva anche portatori femminili di CGD X-linked. Il test di rilascio del superossido misura la riduzione del citocromo c da parte del superossido prodotto dai leucociti attivati presenti nella reazione, consentendo la diagnosi di forme varianti di CGD X-linked. Entrambi i test possono essere facilmente standardizzati in laboratori a bassa complessità e nessuno dei due richiede attrezzature costose. Il test diidrorodamina 123 è un metodo altamente sensibile per la diagnosi biochimica della CGD; tuttavia, richiede un citometro a flusso, uno strumento molto costoso.
Abbiamo valutato l’espressione genica gp91-phox in linfociti B trasformati da EBV da pazienti CGD mediante analisi RT-PCR. Coppie specifiche e sovrapposte di primer sono state utilizzate per amplificare tre regioni del gene gp91-phox mediante RT-PCR: esoni 1-5, 3-9 e 7-13. Questa strategia ha permesso di rilevare l’espressione difettosa di gp91-phox in 7 pazienti su 8. I risultati di RT-PCR hanno confrontato la storia clinica, i dati biochimici (saggio di rilascio di NBT o superossido) e l’analisi di mutazione disponibile in quattro casi. In tre casi supplementari, i risultati di RT-PCR hanno abbinato la storia clinica ed i dati biochimici.
l’espressione genica gp91-phox è stata ridotta in tutte le regioni esoniche del paziente R. B. Questa riduzione può essere il risultato di mutazioni che portano a bassa stabilità dell’RNA o alterata attività trascrizionale. Pazienti G. M. e T. P. ha mostrato un’espressione assente degli esoni 7-13, suggerendo che la ridotta espressione di questi esoni aggiuntivi 3′-end può essere il risultato di instabilità dell’RNA o di un difetto di splicing, ad esempio, parzialmente corretto splicing per produrre un segnale, ma parzialmente anormale splicing per eliminare un sito di legame del primer, un soggetto da indagare da future analisi di mutazione del DNA genomico.
Il paziente G. G. presentava una diffusa, bassa abbondanza, un prodotto di dimensioni più piccole di esoni 1-5 (Figura 1) e un’espressione assente di altre regioni esoniche. La sua analisi di mutazione ha mostrato un difetto nel sito di giunzione dell’esone 3. Allo stesso modo, l’analisi della mutazione del paziente R. S. ha anche rivelato un difetto nel sito di giunzione dell’esone 3. Tuttavia, in questo caso, potrebbe essere rilevato un prodotto PCR meno abbondante.
Il paziente M. F. ha presentato una ridotta espressione delle regioni esoniche 3-9 e 7-13, che può essere il risultato di un’attività trascrizionale difettosa nell’esone 3. JEM ha presentato una mutazione nonsense nell’esone 5 che ha portato alla perdita dell’espressione gp91-phox, come evidenziato dall’analisi RT-PCR, una possibile conseguenza dell’instabilità dell’mRNA mediata da nonsense.
In un caso, paziente T. P. B., l’espressione genica di gp91-phox era normale malgrado una storia familiare compatibile con CGD e un’attività respiratoria difettosa di scoppio. In questo caso, la diagnosi di probabile CGD X-linked era basata su test NBT anormali nella madre e nella sorella, compatibili con lo stato del vettore. Ipotizziamo che una mutazione puntiforme, come una singola sostituzione di base che non cambia la lunghezza o l’abbondanza del frammento di PCR, dovrebbe essere studiata in questo caso particolare.
RT-PCR è un potente strumento per valutare l’espressione genica. Questa caratteristica può parzialmente spiegare la variabilità dell’espressione genica gp91-phox tra i pazienti inclusi in questo studio e l’importanza di combinare coppie sovrapposte di primer per schermare l’intera lunghezza del messaggio. La RT-PCR è stata utilizzata in casi di studio isolati come parte della diagnosi iniziale delle diverse forme di CGD (17-22). L’analisi RT-PCR è stata utile anche nella diagnosi prenatale di CGD, risultante dalla carenza di p47-phox (23). Tuttavia, è stato più comunemente usato per lo studio della regolazione genica dei componenti della NADPH-ossidasi in una varietà di cellule (15,16,24-29). Ad oggi, il potenziale utilizzo di questo utile strumento per stabilire la diagnosi definitiva di CGD X-linked, la forma più frequente, non è stato studiato ampiamente. Ulteriori studi devono essere eseguiti per confrontare la sensibilità e la specificità di questo test rispetto ad altri saggi complessi come Western o Northern blots.
Nel complesso, abbiamo dimostrato che RT-PCR, una metodologia semplice e a basso costo, ha stabilito la diagnosi definitiva di CGD X-linked in 7 casi su 8, senza la necessità di utilizzare metodologie complesse e costose come Northern blot, slot blot, analisi SSCP o sequenziamento del DNA genomico. Pertanto, la RT-PCR può essere uno strumento adatto per diagnosticare la CGD nei laboratori dei paesi in via di sviluppo. È molto importante determinare il difetto genetico molecolare definitivo al fine di fornire la consulenza genetica appropriata e la prognosi ai parenti con CGD. Inoltre, gli studi genetici molecolari del sistema umano NADPH-ossidasi avanzeranno le conoscenze su questo cruciale e antico meccanismo di difesa.
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Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i pazienti e le loro famiglie per la partecipazione e per il loro aiuto, e l’infermiera Silvana Severino per l’assistenza tecnica. Gli autori ringraziano anche il Prof. Peter Newburger, University of Massachusetts Medical School, per una revisione critica di questo manoscritto.
Corrispondenza e note a piè di pagina