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Quantificazione dell’HCV RNA.

Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un semplice test QRT-PCR in tempo reale per la quantificazione dell’RNA HCV in campioni di siero e fegato con rilevamento SYBR Green I piuttosto che l’uso di sonde marcate. I test QRT-PCR in tempo reale sono stati eseguiti con un LightCycler (Roche) con amplificazione a singolo giro e una nuova amplificazione nidificata a ciclo limitato. Gli standard di RNA sono stati trascritti con T7 polimerasi da ampliconi derivati da prodotti PCR a regione non tradotta 5 ‘ clonati in pGEM-T Easy (Promega) e trattati due volte con RQ1 DNasi. L’RNA è stato quantificato mediante spettrofotometria. Per la quantificazione a round singolo dei campioni di siero, l’RNA è stato trascritto al contrario come descritto in precedenza (7). Per la quantificazione della PCR nidificata a ciclo limitato, è stata eseguita una RT-PCR in una reazione in una fase con 15 cicli di PCR (la fase a ciclo limitato), seguita da una QRT-PCR in tempo reale. I carichi HCV sono stati misurati mediante PCR in tempo reale con primer esterni KY78 e KY80 per reazioni a ciclo singolo (21) o primer esterni più primer interni hep21b e hep22 per reazioni annidate a ciclo limitato (19). Le miscele di reazione includevano 2 µl di Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche), 4 mm MgCl2, una concentrazione di 0,5 µM di ciascun primer e 2 µl del modello in un volume totale di 20 µl. Dopo incubazioni per 10 min a 95°C, la PCR LightCycler è stata eseguita per 40 cicli, ogni ciclo composto da 15 s a 95°C, ricottura a 60°C per 5 s ed estensione a 72°C per 10 s. La fluorescenza è stata monitorata a 530 nm e la specificità del segnale è stata controllata mediante analisi della curva di fusione.

Con HCV RNA sintetico come modello, la sensibilità del saggio QRT-PCR in tempo reale a singolo round è stata di circa 103 copie/reazione di HCV o 5 × 104 copie/ml quando è stato calcolato il fattore di diluizione. È stata osservata un’ampia relazione lineare (fino a 6,5 × 108 copie/reazione) tra il numero di cicli di PCR necessari per rilevare un segnale di fluorescenza e il numero di copie di HCV. Abbiamo misurato la carica virale sierica di 24 pazienti cronicamente infettati con vari genotipi HCV prevalenti in Australia (1a, 1b, 2a, 2b, 2c e 3a) (6). Tre pazienti presentavano carichi virali inferiori alla sensibilità di questa versione del test (5 × 104 copie/ml), sebbene fossero positivi da un test qualitativo in-house nidificato RT-PCR (19). I restanti 21 pazienti presentavano carichi virali che variavano da 2,8 × 105 a 9,1 × 106 copie / ml. Per aumentare la sensibilità e la specificità del test, è stata introdotta una RT-PCR a 15 cicli in una fase con una successiva PCR quantitativa in tempo reale per il secondo round. Con l’RNA sintetico, il metodo modificato è stato in grado di rilevare un’ampia gamma di numeri di copia HCV (da 28 a 2,8 × 106 copie HCV/reazione) mantenendo la linearità. La sensibilità del saggio QRT-PCR nidificato a ciclo limitato era maggiore di 28 copie/reazione (o 1.400 copie/ml), che era circa 40 volte maggiore di quella del saggio QRT-PCR a ciclo singolo. La sensibilità di questo test si confronta favorevolmente con quelli dei metodi precedentemente riportati utilizzando la quantificazione in tempo reale con tecnologia TaqMan (Roche) e un sistema di rilevamento di sequenza ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer), che hanno riportato sensibilità di 10 copie/reazione (9, 16) e 1.000 copie/reazione (12). Anche la sensibilità del LightCycler (Roche) e del rilevamento SYBR Green I è stata riportata a 10 copie/reazione (10). Per convalidare ulteriormente questa versione del test, le cariche virali di 16 campioni di siero HCV-positivi, che variavano da 1 × 103 a 1.2 × 106 copie / ml (come determinato con il test Amplicor Monitor), hanno dimostrato di correlare strettamente con i risultati ottenuti con il test QRT-PCR nidificato in tempo reale (r= 0,876, P < 0,0001, n = 16) (Fig. (Fico.11).

HCV replica nel fegato, ma pochi studi hanno tentato di mettere in relazione carichi virali nel fegato ai risultati clinici, preferendo esaminare il valore predittivo di carichi virali sierici. Quest’ultimo potrebbe essere considerato un surrogato adatto per le cariche virali epatiche se si dimostrassero correlate, tuttavia pochi studi lo hanno dimostrato e i risultati riportati fino ad oggi non sono convincenti. Il test QRT-PCR nidificato a ciclo limitato è stato quindi utilizzato per misurare i carichi di HCV epatico. La quantità di tessuto epatico utilizzata per l’analisi pesava tra 0,8 e 8,1 mg (media = 3.88 ± 2,1 mg), da cui è stato estratto da 2,1 a 12,9 µg (media = 6,62 ± 3,1 µg) di RNA. La resa di RNA totale in media 1,71 × 103 µg / g di tessuto epatico, un valore simile a quello trovato in uno studio precedente di 1,01 × 103 µg di RNA/g (13). Le cariche virali epatiche variavano da 3,0 × 102 a 1,3 × 106 molecole di RNA HCV / µg di RNA totale e la media era di 2,38 × 105 ± 3,55 × 105 copie/µg di RNA. È stata dimostrata una correlazione tra la carica virale epatica, misurata in termini di numero di copie di HCV per microgramma di RNA totale, e la carica virale sierica misurata con il test Amplicor Monitor, sebbene fosse debole (r = 0,417, n = 20) (13). Altri studi hanno dimostrato che il carico di RNA HCV nel siero è sostanzialmente riflesso dalla quantità di virus nel fegato senza fornire coefficienti di correlazione (3, 8). Qui, riportiamo per la prima volta una correlazione statisticamente significativa tra le misurazioni della carica virale epatica e sierica (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), indicando che il livello di viremia, infatti, riflette la quantità di virus presente nel fegato (Fig. (Fico.22).

In studi precedenti, le misurazioni della carica virale epatica sono state espresse come il numero di copie per milligrammo di tessuto epatico o il numero di copie per microgramma di RNA totale. In questo studio, mostriamo che entrambe le unità sembrano essere adatte, poiché vi è stata una correlazione significativa tra le cariche virali misurate in termini di numero di copie per milligrammo di tessuto epatico e quelle misurate come numero di copie per microgramma di RNA totale (r = 0,937, P < 0,0001, n = 20) (Fig. (Fico.3).3). Questi risultati sono coerenti con quelli di De Moliner et al. (3), che ha anche dimostrato una stretta correlazione tra la carica virale nel fegato, espressa come il numero di copie per grammo di tessuto, e il numero di copie per microgramma di RNA cellulare totale (r = 0,85) (3). Il numero medio di molecole di RNA HCV per grammo di tessuto epatico era 2,1 × 108 ± 3,71 × 108, circa 170 volte superiore ai livelli di RNA nel siero (1,22 × 106 ± 2,0 × 106 copie / ml). Questa scoperta è simile a quella di Terrault et al. (18), l’oms ha dimostrato che il rapporto tra HCV RNA nel fegato e quello nel siero era 103:1. Al contrario, McGuiness et al. (13) ha rilevato che il livello nel tessuto epatico era maggiore di un fattore >104. Questa differenza può essere correlata al fatto che le cariche virali epatiche dei pazienti dello studio precedente, che avevano prevalentemente un’infezione da HCV avanzata, erano circa otto volte più alte (1,83 × 106 ± 0,75 × 106 copie/µg di RNA) rispetto a quelle registrate nel presente studio (2,38 × 105 ± 3,55 × 105 copie/µg di RNA).

In conclusione, il test QRT-PCR in tempo reale è un metodo sensibile, accurato e affidabile per il monitoraggio dei carichi di HCV nei campioni di siero e fegato.