DISCUSSIONE
Questo studio fornisce la prova che le cellule β possono funzionare bene in un sito di innesto senza cellule non β vicine. Per studiare gli innesti arricchiti da cellule β, le isole dovevano essere disperse in singole cellule per consentire lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. I nostri studi iniziali hanno quindi studiato l’effetto della dispersione e della reaggregazione delle isole sull’esito del trapianto. Quando le cellule disperse erano reaggregate prima del trapianto, erano necessarie meno cellule per invertire l’iperglicemia. Dopo IPGTTs, le isole reaggregate avevano un profilo di glucosio simile ai topi di controllo non diabetici e non trapiantati in base al peso. Tuttavia, i topi trapiantati con 2,5 milioni di cellule isolette disperse avevano livelli di glucosio nel sangue ancora più bassi dopo il test di tolleranza al glucosio. Questo risultato indica che il trapianto di cellule isolette disperse può essere efficiente, a condizione che vengano trapiantati numeri sufficienti. Tuttavia, se le cellule delle isole sono reaggregate prima del trapianto, metà del numero di cellule può ripristinare la normoglicemia. Questi risultati sono in linea con diversi studi precedenti che hanno dimostrato che le risposte secretorie di insulina sono diminuite nelle cellule isolette disperse e sono migliorate dalla reaggregazione delle cellule (24-27). Questo risultato superiore può essere dovuto ad un’influenza positiva della comunicazione cellulare sulla secrezione di insulina e solleva domande sul fatto che le cellule aggregate siano più resistenti all’apoptosi. È probabile che le cellule disperse formino cluster in vivo dopo il trapianto, ma ciò può verificarsi dopo che molte cellule vengono perse nei primi giorni dopo il trapianto. In sintesi, è evidente che un numero maggiore di cellule disperse sono inizialmente necessari per invertire l’iperglicemia.
Nel nostro prossimo studio, le cellule isolette disperse sono state arricchite per le cellule β mediante l’uso dello smistamento cellulare attivato da fluorescenza. le cellule β sono state ordinate in base alla loro fluorescenza endogena e alla dispersione in avanti (dimensione), come è stato precedentemente descritto (19-21). Usando questa tecnica, siamo stati in grado di ottenere popolazioni cellulari di β 95% β-cellule. Queste frazioni arricchite da cellule β sono state poi reaggregate prima del trapianto. I topi che erano stati trapiantati con aggregati arricchiti con cellule β avevano una rapida inversione dell’iperglicemia in modo simile ai topi trapiantati con un volume simile di isole intere. Va notato che il numero di cellule β sarebbe stato inferiore nei trapianti di isole rispetto ai trapianti di cellule β. È probabile che i trapianti di cellule β, con il 95% di purezza delle cellule β, contenessero 2 il 20% in più di cellule β rispetto alle isole. Tuttavia, lo scopo dello studio era stabilire se le cellule β purificate, trapiantate in volumi simili a quelli utilizzati nel trapianto di isole, potessero invertire il diabete e stabilire se le cellule β derivate da cellule staminali potessero mai essere utili per il trapianto di pazienti diabetici. Nei test di tolleranza al glucosio 4 settimane dopo il trapianto, i topi trapiantati con aggregati arricchiti con cellule β avevano livelli di glucosio nel sangue leggermente più bassi e tendevano ad avere livelli di insulina leggermente più alti rispetto a quelli trapiantati con isolotti. Tuttavia, entro 12 settimane non vi era alcuna differenza tra questi gruppi per quanto riguarda la tolleranza al glucosio, i livelli di insulina o il contenuto di insulina da innesto. In questa serie sperimentale, i topi di controllo non diabetici e non trapiantati erano abbinati all’età piuttosto che al peso. Mentre i pesi dei topi trapiantati erano rimasti stabili o diminuiti durante il loro periodo di diabete, i topi di controllo hanno continuato ad aumentare di peso durante lo studio. La loro scarsa tolleranza al glucosio e livelli di insulina più elevati suggeriscono che questi topi di controllo erano diventati insulino-resistenti. Inoltre, i livelli di glucosio più bassi dei topi trapiantati possono essere spiegati dal fatto che sono state impiantate isole di ratto, perché i ratti hanno tipicamente livelli di glucosio più bassi rispetto ai topi e possono avere un set point più basso per la secrezione di insulina stimolata dal glucosio.
Questi risultati mostrano che l’esito del trapianto di aggregati arricchiti con cellule β è simile a quello delle isole. Il trapianto di una popolazione purificata di cellule β è stato precedentemente dimostrato da Keymeulen et al. (28) per avere successo, anche se in questo studio è stato suggerito che la miscelazione di cellule non β endocrine con cellule β prima del trapianto ha migliorato la funzione dell’innesto. Nello studio Keymeulen, gli innesti sono stati studiati per 64 settimane anziché per le 12 settimane in questo studio. I loro innesti di cellule β di ratto e innesti misti di cellule β di ratto più cellule non–β endocrine di ratto hanno funzionato bene nei ratti fino a weeks 20 settimane, quando alcuni degli innesti hanno iniziato a fallire. Entro 64 settimane, tutti gli innesti, indipendentemente dal fatto che contenessero cellule β purificate o cellule β mescolate con altre cellule non β endocrine, avevano parzialmente o completamente fallito. Tuttavia, hanno impiantato circa 1,2-1,7 milioni di cellule β nei ratti, che potrebbero essere considerati come un modello di massa minima. Questo studio approfondito ha anche dimostrato che le cellule β dei donatori di ratto più anziani non funzionano così come le cellule β dei donatori di ratto più giovani. Pertanto, lo studio Keymeulen integra i risultati del presente studio in quanto entrambi mostrano una funzione impressionante di innesti costituiti da cellule β purificate. Un altro tipo di cellula all’interno delle isole che potrebbe potenzialmente contribuire all’esito del trapianto è la cellula endoteliale, che è stata segnalata per contribuire alla rivascolarizzazione delle isole trapiantate (15,16). Tuttavia, non è chiaro che ci siano abbastanza di queste cellule per dare un contributo significativo. Tuttavia, è evidente dagli studi attuali che sebbene le cellule endocrine non β e l’endotelio donatore possano essere utili alla funzione degli innesti di isole trapiantate, non sembrano essere essenziali per il successo del trapianto. Questo risultato indica che le cellule β derivate in vitro da cellule staminali o da qualche altra fonte potrebbero essere molto utili ai fini del trapianto.
Quando la composizione dell’innesto è stata studiata 12 settimane dopo il trapianto, gli aggregati arricchiti con cellule β avevano praticamente lo stesso 5% di cellule non β negli innesti come era nei preparati iniziali. Sebbene ciò non fosse sorprendente, è stato notevole scoprire che le isole che inizialmente avevano il 25% di cellule non β avevano solo il 5% all’interno degli innesti. La stragrande maggioranza di queste cellule sono α-cellule contenenti glucagone. Se gli innesti arricchiti con cellule β avessero perso cellule non β nella stessa misura degli innesti di isole, ci si sarebbe aspettati che avessero solo l ‘ 1% di cellule non β dopo il trapianto. È anche interessante notare che la perdita di cellule non β negli innesti di isole sembrava fermarsi al 5%, che era la stessa percentuale di cellule non β trovata negli innesti arricchiti da cellule β. In accordo con questi risultati, abbiamo anche scoperto che quando i cluster di cellule pancreatiche suine neonatali immature sono stati trapiantati in topi nudi, gli innesti molti mesi dopo erano β 95% cellule β (29). Questo fenomeno degli attuali esperimenti con isole di ratto potrebbe essere spiegato dalla morte preferenziale delle cellule non β come descritto prima (30-33). Questi studi e il nostro concludono che la diminuzione è principalmente rappresentata dalle cellule produttrici di glucagone (30-33). Non sappiamo se scompariranno anche le celle δ e PP. La localizzazione periferica delle cellule α nelle isole di roditori potrebbe potenzialmente renderle più vulnerabili ai danni durante l’isolamento. Anche se non abbiamo studiato questo in dettaglio nel presente studio, studi precedenti hanno indicato che questo non è il motivo principale per la perdita di α-cellule dopo il trapianto. In uno studio di Lau et al. (33), le isole impiantate nel fegato avevano perso α-cellule a 4 settimane dal trapianto, mentre le isole impiantate nel rene dallo stesso isolamento non lo avevano fatto, indicando che gli eventi correlati all’isolamento non avevano causato la perdita di queste cellule periferiche (33). In tale studio, gli isolotti impiantati per via intraportale hanno mostrato perdita di cellule α, mentre gli isolotti impiantati sotto la capsula renale non hanno mostrato perdita di cellule α. Nel presente studio, abbiamo visto la perdita di cellule non β nelle isole sotto la capsula renale 1 settimana dopo l’impianto. Una differenza tra il loro studio e questo studio è che hanno impiantato isole in ratti normoglicemici, mentre nel presente studio, i destinatari erano topi iperglicemici. È possibile che le differenze nel carico metabolico sull’innesto dell’isolotto possano influenzare la sopravvivenza delle cellule α. Non si può escludere che la perdita di α-cellule sia più rapida nel sito del fegato, come Lau et al. (33) segnalato. Gunther et al. (31) ha riportato la perdita di α-cellule già 2 giorni dopo l’impianto nel fegato di ratti diabetici (31). Poiché i livelli normali di glucagone e di altri peptidi derivati dalle cellule non β sono ancora prodotti dal pancreas endogeno, è possibile che le cellule non β negli innesti scompaiano a causa dell’involuzione per prevenire l’iperglucagonemia.
La domanda ipotetica, che un giorno potrebbe essere di importanza pratica, è se un innesto di cellule β pure fornirebbe un risultato di trapianto adeguato. In termini di effetti metabolici di tutto il corpo della secrezione di glucagone da innesti, sembra che la secrezione da innesti fornisca una protezione minima contro l’ipoglicemia acuta (34), tuttavia i trapianti di isole umane possono mantenere livelli di glucosio quasi normali. La secrezione persistente di glucagone dal pancreas può dare un certo contributo all’omeostasi del glucosio ma, ancora una volta, poca protezione contro l’ipoglicemia acuta. Queste risposte di glucagone carenti potrebbero rendere i destinatari più inclini all’ipoglicemia durante l’esercizio (35,36), ma è improbabile che ciò superi i benefici. La prossima domanda è se ci sia qualche importante influenza locale delle cellule non β dell’isolotto sulla funzione delle cellule β. Considerando l’anatomia microvascolare dell’isolotto e gli esperimenti fisiologici che dimostrano che le cellule non β sono a valle delle cellule β (13,14), sembra probabile che la maggior parte delle cellule β non sia influenzata da cellule non β. Alcune informazioni possono essere fornite dalle nostre misurazioni che hanno determinato quanto lontano le cellule β erano lontane dalle cellule non β. Quando abbiamo quantificato il numero di cellule β che si trovavano in prossimità di una cellula non β, è stato riscontrato che il 65-75% delle cellule β erano 50 µm da una cellula non β. Sembra improbabile che la secrezione locale da cellule non β possa avere molta influenza paracrina a quella distanza. Inoltre, da studi di altri (37,38), sappiamo che la microvascolatura delle isole trapiantate è molto diversa dal normale. Pertanto, l’anatomia degli innesti di isole è molto diversa dalle isole del pancreas, ma questi innesti sono ancora efficaci nell’invertire l’iperglicemia nei pazienti diabetici.
In conclusione, abbiamo scoperto che gli aggregati arricchiti con cellule β possono efficacemente invertire l’iperglicemia nei topi e che le isole intatte trapiantate sono esaurite nelle cellule non β. È quindi probabile che le cellule non β delle isole non siano essenziali per il successo del trapianto di isole.