Braz J Med Biol Res,May2004,Volume2005,2006,2007,2008,2009,2009,2009,2009,2009,2009 37(5) 625-634
X連鎖性慢性肉芽腫性疾患の診断のための逆転写-PCRの使用
P.Agudelo-Flórez1,J.A.López1,J.Redher1,M.M.S.Carneiro-Sampaio2,B.T.Costa-Carvalho3,A.S.Grumach4およびA. Condino-Neto1
1centro de Investigação em Pediatria,And The Departments of Pediatrics and Pharmacology,Faculty of Medical Sciences,State University of Campinas,Campinas,SP,Brazil
2Departamento of Immunology,Institute of Biomedical Sciences,Universidade de São Paulo,São Paulo,SP,Brazil.
3アレルギー、免疫学およびリウマチ学、小児科、Escola Paulista de Medicina、Universidade Federal de São Paulo、São Paulo、SP、ブラジル。
4ラボラトリオ医学研究56,医学部皮膚科,, Universidade de São Paulo,São Paulo,SP,Brasil
要約はじめに患者と方法結果ディスカッション 謝辞対応と脚注
要約
慢性肉芽腫性疾患（CGD）は、食細胞の欠陥のある酸化的バーストとその後の殺菌活性の障害を特徴とする自然免疫系の遺伝性障害である。 NADPH-オキシダーゼ成分の一つの変異は、CGDの表現型につながる、このシステムの遺伝子発現または機能に影響を与えます。 Gp91-phoxの欠陥は、Cgd症例の約70％を担当するXリンクCGDにつながります。 CGDの患者の非常に異質遺伝子型の調査は特定の場合に従って突然変異の分析、ノーザンブロットまたは西部のしみの試金を含んでいます。 本研究の目的は、逆転写（RT）-PCR八ブラジル患者におけるXリンクCGDの責任分子欠陥の分析のために使用し、CGDにおける分子スクリーニングへのより広範な エプスタインＢウイルス形質転換Ｂリンパ球から全ＲＮＡを調製し，ランダムヘキサマーを用いて逆転写した。 得られたｃＤＮＡを、ｇｐ９ １−ｐｈｏｘ遺伝子の３つの領域：エクソン１−５、３−９、および７−１ ３を増幅するように設計された特異的および重複するプライマー対によってＰＣＲ増幅 この戦略は、七人の患者における欠陥のあるgp91-phox発現を検出した。 ＲＴ-ＰＣＲの結果は，臨床歴，生化学的データ（ニトロブルーテトラゾリウムまたはスーパーオキシド放出アッセイ）および四つの症例で利用可能な変異解析と一致した。 三つの追加のケースでは、RT-PCRの結果は、臨床歴と生化学的データと一致しました。 別のケースでは、RT-PCRはCGDと欠陥のある呼吸バーストと互換性のある臨床病歴にもかかわらず正常であった。 我々は、RT-PCR分析のこの新しいアプリケーション-簡単で経済的かつ迅速な方法-7の8XリンクCGD患者の分子欠陥をスクリーニングするために適切であった
キーワード：スーパーオキシド、食細胞、原発性免疫不全、呼吸バースト、好中球、ヒト
はじめに
慢性肉芽腫性疾患（CGD）は、もともと1957年に男性の乳児に影響を与える臨床的実体として記載され、当時、小児期の致命的な肉芽腫性疾患と命名された原発性免疫不全である。 CGDの主な特徴は、気道やリンパ節などの生物の自然の障壁、そして最終的には肝臓、脾臓、骨、脳などの内部構造を含む再発性および重度の感染症です（1-3）。 このまれな病気の推定発生率は1年あたりの1/250,000の生きている生れです。 感染症は、一般的に、黄色ブドウ球菌、グラム陰性桿菌、およびアスペルギルス、カンジダおよびノカルディア（4,5）などの真菌種などのカタラーゼ陰性細菌に
NADPH-オキシダーゼ系は、食細胞の殺菌活性に重要なスーパーオキシドおよび他の活性酸素中間体を生成する。 CGDの生化学的欠陥は、NADPH-オキシダーゼ活性の障害およびその後の微生物を破壊することができないことである（6）。 NADPH-オキシダーゼ系の主要な構成要素は、gp91-、p22-、p47-、p67-、およびp40-phoxである。 ＣＧＤを引き起こす分子欠陥は、一般に、ＮＡＤＰＨ−オキシダーゼ成分の１つの不在、低発現または機能不全によるものである。 この疾患のX結合型は、gp91-phox、シトクロムb588の重鎖の欠陥によって引き起こされ、すべての症例（7,8）の約70％を占めています。 常染色体劣性型は、NADPHオキシダーゼの細胞質成分（それぞれ20および5％の症例でp47またはp67-phox）、またはシトクロムb588軽鎖成分（p22-phox、症例の5％）（9,10）のいずれかの欠損によって引き起こされる。 CGDは非常に不均一な状態であり、国際的に維持されているX-CGDデータベースには300以上の変異が登録されています(8)。 変異は、主に13エクソン内またはgp91-phox（CYBB）遺伝子のエクソン/イントロン境界に分布しており、これらの変異のほぼ200はユニークです。
CGDの診断は、一般的に、異常なnitroblue tetrazolium(NBT)、ジヒドロホダミン123、またはスーパーオキシド放出アッセイによって示されるように、疾患の臨床的特徴に加えてNADPH-オキシダーゼ活性の欠陥に基づいている(11,12)。 刺激されたNBT試験では、正常な個体はほぼ100％陽性細胞を示し、CGD患者では細胞の5％未満が陽性である（13）。 さらに、変異型CGDを有する患者由来の細胞は陽性であるが、非常に低い活性しか示さない（6）。 NBTテストはまたXリンクされたCGD（母および姉妹）のキャリアを検出します。 決定的な分子CGD診断は、gp91-、p22-、p47-、またはp67-phoxの変異;ノーザンブロット分析によって検出されたこれらの遺伝子のいずれかのmrnaが存在しない;および/またはウェスタンブロットによってこれらのオキシダーゼ成分のいずれかのタンパク質が存在しないという特徴を有する異常なNBT検査または呼吸バースト活性を有する患者において確立される。 遺伝的ではあるが分子的ではない診断は、異常なNBT検査または呼吸バースト（14）を有する母親のいとこ、叔父、または甥の実証によって確立することがで したがって、このまれで高度に異質な疾患の確定診断の確立は、ノーザンブロットまたはウェスタンブロットの組み合わせ、およびいくつかの家族のDNAシーケ＜5145＞＜7342＞逆転写-PCR（RT-PCR）法は、PCRによるcDNAの増幅を伴う。 この技術はより少なく洗練された実験室で容易に標準化することができる。 これは、遺伝子発現に関する情報および欠陥成分のmRNAの構造またはサイズに関する予備データを提供する。 RT-PCRは、cgd研究ではほとんど使用されておらず、病態生理学研究に限定されている（15-29）。 今日まで、最も頻繁な形態であるXリンクCGDの確定診断を確立するためのこの有用なツールの潜在的な使用は、広範囲に調査されていない。 本研究の目的は、XリンクCGD、まれであり、おそらく誤診免疫不全の原因となる分子欠陥をスクリーニングするためのRT-PCRの使用を評価することでした。
患者と方法
患者
この研究には、XリンクCGDの可能性がある無関係の男性ブラジル人患者8人（黒人2人と白人6人、年齢2-8歳、身長88-108cm、体重11-19kg）が含まれていた。 患者は肺炎，リンパ節炎，肝膿よう，膿皮症，ＢＣＧ免疫に対する副作用などの再発性重症感染症の臨床歴を示した。 それらは生化学的および分子診断評価のための私達の実験室に参照されました。 書面によるインフォームドコンセントは、研究の前に参加者から得られた。 医学部倫理委員会は、ヘルシンキ条約およびブラジル保健省決議196/96に従って議定書を承認した。
CGDの生化学的診断
Cgdの生化学的診断は、Pan American Group for Immunodeficiencies基準に従って確立されました。 NADPH-オキシダーゼ活性の障害は、NBTスライドテストおよび/または末梢血好中球および単核白血球（14,30,31）によるスーパーオキシドアニオン放出アッセイによっ 好中球および単核白血球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配（３ ２）上で血液試料を遠心分離することによって得た。
NBTスライド試験は、活性化白血球によるnbtのホルマザンへの還元に基づいて行われた(31)。 アッセイは、以前に記載されたように行った（３ ０）。 30nMホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸（PMA）で刺激された200正常好中球の95％以上がNBTを減少させることができるはずである。 不在反応または<5％陽性細胞は、CGDの診断を示すと考えられた（14）。
好中球および単核白血球による定量的スーパーオキシド放出を、修飾スーパーオキシドジスムターゼ阻害性シトクロムc還元アッセイ（33-35）によって評価した。 放出されたスーパーオキシドの量は、シトクロムcの0.21nM/cmの吸光係数を用いて計算された。 CGDを有する患者は、対照値の10％未満を示した。
X結合CGDの原因となる分子欠陥のスクリーニング
x結合cgd患者のBリンパ球をエプスタインBウイルス（EBV）（15,16）でin vitroで形質転換し、分子研究のための核酸の豊富な供給源を提供した。 EBV形質転換されたB細胞株は、CGD患者（15,16,36）の生化学的および分子的欠陥を再現し、繰り返しの血液採取の必要性を排除する。 簡単には、xリンクCGD患者からの末梢血白血球は、B95-8、EBVプロデューサー細胞株（15,16,36,37）、熱不活性化胎児ウシ血清（10％）、2mM L-グルタミン、100U/mlのペニシリン、および100μ g/mlのストレプトマイシンを補充したRPMI1640培地中で、37℃で、5％CO2の湿った雰囲気中で培養した。 細胞生存率をモニターし、培養物を試験期間を通して維持した。
EBV形質転換B細胞株からのRNAサンプルは、グアニジンHCl法によって調製した後、エタノール沈殿および標準的な方法による定量（38,39）によって調製した（38,39）。 ＣＤＮＡサンプルは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｉ Ｉ ＲＴ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）およびランダムヘキサマー（１ ５）を用いて２μ ｇの全ＲＮＡを逆転写することによって得た。 ＭＲＮＡサンプルの品質を、構成遺伝子対照であるγ−アクチン（ｂｐ９ ２ ０−９ ４ ３およびｂｐ１ ４ ９ ４−１ ４ ７ １）のＰＣＲ増幅によってチェックした（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． NM001101）。＜５ １ ４ ５＞＜７ ３ ４ ２＞ｇｐ９ １−ｐｈｏｘ遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにより評価した。 プライマーの特異的および重複する対（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０ ０ ０ ３ ９ ７、表１）を使用して、３つのｇｐ９ １−ｐｈｏｘエキソニック領域：１−５、３−９、および７−１ ３を増幅した（３ ０サイクル）。 この戦略により、すべてのgp91-phoxエクソンをスクリーニングすることができました。 PCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分析し、臭化エチジウムで染色した。＜５ １ ４ ５＞＜７ ３ ４ ２＞相対的なｇｐ９ １−ｐｈｏｘ遺伝子発現を、Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて解析した。 標的試料の濃度測定結果を構成遺伝子制御であるγ-アクチンの濃度測定結果で除算し，分析のために考慮されるレベルを正規化した。 RT-PCRアッセイの結果は、患者の臨床歴、生化学的アッセイ（NBTおよび/またはスーパーオキシド放出アッセイ）、および利用可能な変異解析データ（http://www.sbi.org.br/Sbi2003/インデックス。htm）。
結果
私たちは、cgdの生化学的および分子診断のための私たちの研究室を参照して、再発性重症感染症の臨床歴を持つ8人の男性患者を研究しました。 ＮＢＴスライド試験およびスーパーオキシド放出アッセイの結果を表２に示す。 患者の六つは、NBTスライドテストで5％未満の陽性白血球を提示しました。 六人の患者は、顆粒球および/または単核白血球によるスーパーオキシド放出の障害を示した（健康な対照と比較して10％未満）。 両検査で四人の患者が異常な結果を示した。 すべての患者は、少なくとも一つの異常検査を提示し、可能性のあるXリンクCGDの診断を受けました。 患者Ｔ．Ｂ．Ｐ．の母親と姉妹は，ＸリンクＣＧＤのキャリア状態と互換性のあるＮＢＴスライドテストを提示した。 研究期間中、一人の患者（G.M.）が肺炎で死亡した。
我々は、次にgp91-phox遺伝子発現のRT-PCR解析によってXリンクCGDの確定診断を検討しました。 ３組の重複プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を表２に示す。 構成遺伝子コントロールであるγ-アクチンのＰＣＲ増幅によりｍｒｎａサンプルの品質をチェックした。 この場合、予想される正常な製品が得られた（図1、2および3）。
4つのケースでは、RT-PCRデータを利用可能な突然変異解析と一致させることが可能であり、Patiñoらによって他の場所で提示された。 （30）または当社グループ（//www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm):j.E.M.は、ナンセンス変異（R157X）を予測し、エクソン5におけるC469®T遷移を提示しました。 M.F.エクソン3、R（アルギニン）73-ストップでナンセンス置換を提示した。 R.S.はgp91-phoxエクソン3の3’スプライス接合部で264G(商標)a置換を示した。 CDNA配列は、不安定または非機能変異gp91-phoxを生じさせる、gp91-phoxエクソン3の欠失を示した。 G.G. gp91-phoxエクソン3の欠陥スプライシングを提示した（根底にある突然変異はまだ決定されていない）。 他の患者は引き続き調査中です。
全体として、この戦略は、8人の患者のうち7人でgp91-phox発現の欠損を検出することを可能にした。 ＲＴ-ＰＣＲの結果は，臨床歴，生化学的データ（ＮＢＴまたはスーパーオキシド放出アッセイ）および四つの症例で利用可能な変異解析と一致した。 三つの追加のケースでは、RT-PCRの結果は、臨床歴と生化学的データと一致しました。 別のケースでは、RT-PCRは、CGDと互換性のある臨床病歴、NBTテストとスーパーオキシド放出アッセイとxリンクCGDキャリア状態と互換性のある母親と妹のNBTテス
ディスカッション
本稿では、詳細な調査のために私たちの研究室に紹介されたCGDの臨床歴を持つ8人の無関係なブラジルの男性患者の生化学的およ ＣＧＤは食細胞がスーパーオキシドアニオンおよび他の活性酸素中間体を生成することができないまれな遺伝性障害である。 ＮＢＴスライド試験やスーパーオキシドアニオン放出アッセイなどの生化学的方法により，ｘ連鎖ＣＧＤの可能性のある診断を確立した。 我々の結果は、すべての患者が障害NADPH-オキシダーゼ機能と、順番に、可能性の高いXリンクCGDを提示したことを示した。
両方の方法は、異なる方法でCGDの可能性のある診断に寄与する。 NBTスライドテストは、細胞質内のホルマザンにNBTを減少させる細胞の数と、この減少の強さについての情報を提供します。 したがって、xリンクCGDの変異型を有する患者は、異常なNBTスライド試験を示し、細胞の大部分がNBTをホルマザンに弱く減少させる。 NBTスライドテストはまたXリンクされたCGDの女性のキャリアを検出する。 スーパーオキシド放出アッセイは、反応中に存在する活性化白血球によって生成されるスーパーオキシドによるシトクロムcの還元を測定し、X結合CGDの異 両方の試験は、複雑度の低い試験所で容易に標準化することができ、高価な装置を必要としません。 Dihydrorhodamine123テストはCGDの生化学的な診断のための感度が高い方法です;但し、それは流れのcytometer、非常に高い器械を要求します。
我々は、RT-PCR解析によりCGD患者からEBV形質転換Bリンパ球におけるgp91-phox遺伝子発現を評価しました。 プライマーの特異的および重複するペアは、RT-PCRによってgp91-phox遺伝子の三つの領域を増幅するために使用された：エクソン1-5、3-9、および7-13。 この戦略は、欠陥のあるgp91-phox発現7の8患者の検出を可能にしました。 ＲＴ-ＰＣＲの結果は，臨床歴，生化学的データ（ＮＢＴまたはスーパーオキシド放出アッセイ）および四つの症例で利用可能な変異解析と一致した。 三つの追加のケースでは、RT-PCRの結果は、臨床歴と生化学的データと一致しました。
gp91-phox遺伝子の発現は、患者R.Bのすべてのエキソニック領域で減少しました。 患者G.M.およびT.P. エクソン7-13の発現が存在しないことを示し、これらの追加の3’末端エクソンの発現の減少は、RNA不安定性またはスプライシング欠陥、例えば、部分的に正
患者G.g.は、拡散し、存在量が低く、エクソン1-5の小さいサイズの生成物（図1）、および他のエクソン領域の発現がないことを示した。 彼の変異解析は、エクソン3スプライス部位に欠陥を示した。 同様に、患者R.S.の変異解析はまた、エクソン3スプライス部位に欠陥を明らかにした。 しかし、この場合には、あまり豊富でないＰＣＲ産物が検出され得る。
患者M.F.は、エクソン3における転写活性不良の結果であり得るエクソン領域3-9および7-13の発現低下を提示した。 J.E.M.は、RT-PCR解析、ナンセンス媒介mRNA不安定性の可能な結果によって証明されるように、gp91-phox発現の損失をもたらしたエクソン5のナンセンス変異を提
あるケースでは、患者T.P.B.、gp91-phox遺伝子発現は、CGDと欠陥のある呼吸バースト活性と互換性のある家族歴にもかかわらず正常であった。 この場合，ｘ連鎖ＣＧＤの診断は，母親と妹の異常なＮＢＴ検査に基づいており，キャリアの状態と一致していた。 我々は、この特定のケースでは、PCR断片の長さまたは存在量を変化させない単一の塩基置換などの点突然変異を調査すべきであると仮定している。
RT-PCRは遺伝子発現を評価するための強力なツールです。 この特性は、部分的にこの研究に含まれる患者の間でgp91-phox遺伝子発現の変動、およびメッセージの完全な長さをスクリーニングするためにプライマーの重 RT-PCRは、異なる形態のCGDの初期診断の一部として単離されたケーススタディで使用されている（17-22）。 RT-PCR解析は、p47-phox欠乏症（23）に起因するCGDの出生前診断にも有用であった。 しかし、それは様々な細胞（15,16,24-29）におけるNADPH-オキシダーゼ成分の遺伝子調節の研究のためにより一般的に使用されている。 今日まで、最も頻繁な形態であるXリンクCGDの確定診断を確立するためのこの有用なツールの潜在的な使用は、広範囲に調査されていない。 それ以上の調査は西部かノーザンブロットのような他の複雑な試金と比較されるこのテストの感受性そして特定性を比較するために行われるべき
全体的に、我々は、Rt-PCR、シンプルで低コストの方法論は、ノーザンブロット、スロットブロット、SSCP分析、またはゲノムDNAシークエンシングなどの複雑で高価な方法論を使用することなく、7の8例でXリンクCGDの確定診断を確立したことを実証している。 したがって、RT-PCRは、発展途上国の実験室でCGDを診断するための適切なツールであり得る。 ＣＧＤを有する親族に適切な遺伝カウンセリングと予後を提供するためには，決定的な分子遺伝的欠損を決定することが非常に重要である。 さらに、ヒトNADPH-オキシダーゼ系の分子遺伝学的研究は、この重要で古代の防御機構についての知識を前進させるでしょう。
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謝辞
著者は、患者とその家族が参加し、彼らの助けを借りて、看護師Silvana Severinoが技術支援を受けたことに感謝します。 著者はまた、この原稿の批判的なレビューのために、マサチューセッツ大学医学部のPeter Newburger教授に感謝します。
対応と脚注