Braz J Med Biol Res, Mai 2004, Volum 37(5) 625-634
bruken av revers transkripsjon-PCR for diagnostisering Av x-bundet kronisk granulomatøs sykdom
P. Agudelo-Fló 1, J. A. Ló 1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 og A. Condino-Neto1
1Centro De Investigaçã I pediatria, og avdelingene for pediatri Og farmakologi, Medisinske Fakultet, State University of campinas, Campinas, sp, brasil
2departamento for immunologi, Institutt for biomedisinsk Vitenskap, Universidade De Sã Paulo, Sã Paulo, sp, brasil.
3disiplina Av Allergi, Immunologi og Reumatologi, Institutt For Pediatri, Escola Paulista De Medicina, Universidade Federal De Sã Paulo, Sã Paulo, SP, Brasil.
4laborató Medisinsk Forskning 56, Institutt For Dermatologi, Det Medisinske Fakultet,, Universidade De Sã Paulo, Sã Paulo, SP, Brasil
Abstrakt
Introduksjon
Pasienter Og Metoder
Resultater
Diskusjon Bekreftelser
Korrespondanse Og Fotnoter
Abstrakt 
Kronisk granulomatøs sykdom (Cgd) er En arvelig sykdom i det medfødte immunsystemet preget av en defekt oksidativ utbrudd av fagocytter og påfølgende svekkelse av deres mikrobicide aktivitet. Mutasjoner i EN AV NADPH-oksidasekomponentene påvirker genuttrykk eller funksjon av dette systemet, noe som fører til fenotypen AV CGD. Defekter i gp91-phox fører Til X-bundet CGD, som er ansvarlig for omtrent 70% AV CGD-tilfellene. Undersøkelse av den svært heterogene genotypen AV CGD-pasienter inkluderer mutasjonsanalyse, Northern blot eller Western blot-analyser i henhold til det spesielle tilfellet. Målet med denne studien var å bruke revers transkripsjon (RT)-PCR for analyse av molekylære defekter som er ansvarlige For X-bundet CGD hos åtte Brasilianske pasienter og å vurdere potensialet for bredere anvendelse på molekylær screening i CGD. Totalt RNA ble fremstilt Fra Epstein b virus-transformerte b-lymfocytter og revers transkribert ved hjelp av tilfeldige hexamers. Den resulterende cDNA BLE PCR-forsterket av spesifikke og overlappende par primere designet for å forsterke tre regioner av gp91-phox-genet: eksoner 1-5, 3-9 og 7-13. Denne strategien oppdaget defekt gp91-phox-uttrykk hos syv pasienter. RT-PCR-resultatene samsvarte med klinisk historie, biokjemiske data (nitroblue tetrazolium eller superoksydfrigjøringsanalyse) og tilgjengelig mutasjonsanalyse i fire tilfeller. I ytterligere tre tilfeller matchet RT-PCR-resultatene klinisk historie og biokjemiske data. I et annet tilfelle VAR RT-PCR normalt til tross for en klinisk historie kompatibel MED CGD og defekt respiratorisk utbrudd. Vi konkluderer med at DENNE nye anvendelsen AV RT-PCR-analyse – en enkel, økonomisk og rask metode-var egnet for screening av molekylære defekter hos 7 av 8 X-koblede CGD-pasienter.
Stikkord: Superoksid, Fagocytter, Primær immunsvikt, Respiratoriske burst, Nøytrofile, Human
Innledning
Kronisk granulomatøs sykdom (Cgd) er en primær immunsvikt opprinnelig beskrevet i 1957 som en klinisk enhet som påvirker mannlige spedbarn og navngitt, på den tiden, dødelig granulomatøs sykdom i barndommen. De viktigste egenskapene TIL CGD er tilbakevendende og alvorlige infeksjoner som involverer de naturlige barrierer av organismen som luftveiene og lymfeknuter, og til slutt indre strukturer som lever, milt, bein og hjerne (1-3). Den estimerte forekomsten av denne sjeldne sykdommen er 1/250 000 levendefødte per år. Infeksjonene er vanligvis forårsaket av katalase-negative bakterier som Staphylococcus aureus, Gram-negative baciller og sopparter som Aspergillus, Candida og Nocardia (4,5).
NADPH-oksidasesystemet genererer superoksid og andre reaktive oksygen mellomprodukter, avgjørende for fagocytes mikrobicide aktivitet. Den biokjemiske defekten i CGD er en svekkelse AV NADPH-oksidaseaktivitet og påfølgende manglende evne til å ødelegge mikroorganismer (6). De viktigste komponentene I NADPH-oksidasesystemet er gp91 -, p22 -, p47 -, p67-og p40-phox. Molekylære defekter som forårsaker CGD skyldes vanligvis fravær, lavt uttrykk eller funksjonsfeil hos EN AV NADPH-oksidasekomponentene. Den X-koblede formen av denne sykdommen skyldes defekter i gp91-phox, den tunge kjeden av cytokrom b588, og står for ca 70% av alle tilfeller (7,8). De autosomale recessive former er forårsaket av defekter i en av de cytosoliske komponentene AV NADPH oksidase (p47 – eller p67-phox, henholdsvis i 20 og 5% tilfeller), eller cytokrom b588-lettkjedekomponenten (p22-phox, 5% tilfeller) (9,10). CGD er en svært heterogen tilstand: over 300 mutasjoner er registrert i en internasjonalt vedlikeholdt x-CGD database (8). Mutasjonene har blitt distribuert i stor grad innenfor 13 eksoner eller ved exon/intron-grensene til gp91-phox (CYBB) – genet, og nesten 200 av disse mutasjonene er unike.
diagnosen CGD er generelt basert på de kliniske egenskapene til sykdommen pluss defekt NADPH-oksidaseaktivitet som demonstrert ved unormal nitroblue tetrazolium (NBT), dihydorhodamin 123 eller superoksydfrigjøringsanalyser (11,12). I DEN stimulerte NBT-testen viser normale individer nesten 100% positive celler, mens hos CGD-pasienter er færre enn 5% av cellene positive (13). I tillegg er celler fra pasienter med variant CGD positive, men viser bare svært lav aktivitet (6). NBT-testen oppdager også bærerne Av X-koblet CGD (mødre og søstre). En endelig molekylær cgd-diagnose er etablert hos pasienter med en unormal NBT-test eller respiratorisk burstaktivitet som har en av følgende egenskaper: en mutasjon i gp91-, p22-, p47-eller p67-phox; fraværende mRNA for et av disse genene oppdaget Ved Northern blot-analyse; Og/eller fraværende protein for En av disse oksidasekomponentene Ved Western blot. En genetisk, men ikke molekylær, diagnose kan etableres ved demonstrasjon av mors fettere, onkler eller nevøer med en unormal NBT-test eller respiratorisk utbrudd (14). Dermed krever etableringen av en endelig diagnose av denne sjeldne og svært heterogene sykdommen komplekse og dyre metoder som en kombinasjon Av Northern blot eller Western blot, og single-strand konformasjon polymorfisme analyse (SSCP) etterfulgt AV DNA-sekvensering av flere familiemedlemmer, alle utført i høy kompleksitet forskningslaboratorier.
omvendt transkripsjon-PCR (RT-PCR) – metoden innebærer forsterkning av cDNA VED PCR. Denne teknikken kan enkelt standardiseres i mindre sofistikerte laboratorier. Det gir informasjon om genuttrykk og foreløpige data om strukturen eller størrelsen på mRNA til den defekte komponenten. RT-PCR har sjelden blitt brukt I CGD-forskning, og er begrenset til patofysiologistudier (15-29). Hittil har den potensielle bruken av dette nyttige verktøyet for å etablere den endelige diagnosen X-bundet CGD, den hyppigste formen, ikke blitt grundig undersøkt. Målet med denne studien var å evaluere BRUKEN AV RT-PCR for screening av molekylære defekter som er ansvarlige For X-bundet CGD, en sjelden og muligens feildiagnostisert immunsvikt, hos åtte Brasilianske pasienter.
Pasienter Og Metoder
Pasienter
studien inkluderte 8 urelaterte Mannlige Brasilianske pasienter med sannsynlig X-bundet CGD (2 Svarte og 6 Kaukasiere; alder 2-8 år; høyde 88-108 cm; vekt 11-19 kg). Pasientene presenterte klinisk historie med tilbakevendende alvorlige infeksjoner som pneumoni, lymfadenitt, leverabscess, pyodermitt og bivirkninger av BCG-immunisering. De ble henvist til vårt laboratorium for biokjemisk og molekylær diagnostisk evaluering. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra deltakerne før studien. Medical School Ethics Committee godkjente protokollen i samsvar Med Helsinki-Konvensjonen Og Brasils Helsedepartement, Resolusjon 196/96.
Biokjemisk diagnose AV CGD
den biokjemiske diagnosen CGD ble etablert i Henhold Til Pan American Group for Immunodeficiencies kriterier. En svekkelse AV NADPH-oksidaseaktivitet ble demonstrert VED NBT slide test og / eller superoxide anion release assay av perifere blodnutrofiler og mononukleære leukocytter (14,30,31). Nøytrofiler og mononukleære leukocytter ble oppnådd ved sentrifugering av blodprøver over En Ficoll-Hypaque tetthetsgradient (32).
NBT-lysbildetesten var basert på reduksjon AV NBT til formazan ved aktiverte leukocytter (31). Analysen ble utført som tidligere beskrevet (30). Mer enn 95% av 200 normale nøytrofiler stimulert med 30 nM phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) skal kunne redusere NBT. Manglende reaksjon eller < 5% positive celler ble vurdert for å indikere en DIAGNOSE AV CGD (14).
Kvantitativ superoksidfrigivelse ved nøytrofiler og mononukleære leukocytter ble vurdert ved en modifisert superoksiddismutasehemmelig cytokrom c-reduksjonsanalyse (33-35). Mengden superoksid frigjort ble beregnet ved hjelp av en utryddelseskoeffisient på 0,21 nM/cm for cytokrom c. resultatene rapporteres som nmol superoksid frigjort av 106 celler per time. Pasienter med CGD viste mindre enn 10% av kontrollverdiene.
Screening molekylære defekter ansvarlig For X-bundet CGD
B-lymfocytter Fra x-bundet cgd pasienter ble transformert in vitro Med Epstein b virus (EBV) (15,16) for å gi en rikelig kilde til nukleinsyrer for molekylære studier. DE EBV-transformerte b-cellelinjene reproduserer biokjemiske og molekylære defekter HOS CGD-pasienter (15,16,36), og eliminerer behovet for gjentatte blodsamlinger. Kort fortalt ble perifere blodleukocytter fra X-koblede CGD-pasienter dyrket med supernatanter Fra B95-8, EN EBV-produsentcellelinje (15,16,36,37), I rpmi 1640 medium supplert med varmeinaktivert føtalt bovint serum (10%), 2 mM l-glutamin, 100 E/ml penicillin og 100 µ/ml streptomycin, VED 37ºC, i en fuktig atmosfære med 5% CO2. Cellens levedyktighet ble overvåket og kulturene ble opprettholdt gjennom hele studieperioden.
rna-prøver fra EBV-transformerte b-cellelinjer ble fremstilt ved guanidin HCl-metoden, etterfulgt av etanolutfelling og kvantifisering ved standardmetoder (38,39). CDNA-prøvene ble oppnådd ved revers transkripsjon av 2 µ av totalt RNA med Hevet Ii RT (GIBCO BRL) og tilfeldige heksamere (15). Kvaliteten på mRNA-prøvene ble kontrollert VED PCR-forsterkning av ß-actin, en konstitutiv genkontroll (bp 920-943 og bp 1494-1471) (Genbank tiltredelse Nr. NM001101).
gp91-phox-genuttrykk ble vurdert VED RT-PCR. Spesifikke og overlappende par primere (Gen Bank tiltredelse Nr. NM_000397, Tabell 1) ble brukt til å forsterke (30 sykluser) tre gp91-phox eksoniske regioner: 1-5, 3-9 og 7-13. Denne strategien tillot oss å skjerme alle gp91-phox exons. PCR-produkter ble analysert ved 2% agarosegelelektroforese og farget med etidiumbromid.
Relativ gp91-phox genuttrykk ble analysert Med Image Master Software (Pharmacia-Biotech). Densitometriresultatet for målprøver ble delt på densitometriresultatet av ß-actin, en konstitutiv genkontroll, som normaliserte nivået som ble vurdert for analyse. RESULTATENE AV RT-PCR-analyser ble sammenlignet med pasientens kliniske historie, biokjemiske analyser (NBT og/eller superoksydfrigjøringsanalyse) og tilgjengelige mutasjonsanalysedata (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ indeks.htm).
Resultater
vi studerte 8 mannlige pasienter med klinisk historie med tilbakevendende alvorlige infeksjoner, referert til vårt laboratorium for biokjemisk og molekylær diagnose AV CGD. Resultatene av NBT-lysbildetestene og superoksydfrigjøringsanalysene er vist I Tabell 2. Seks av pasientene presenterte mindre enn 5% positive leukocytter i NBT-lysbildetesten. Seks pasienter viste nedsatt superoksidutslipp av granulocytter og / eller mononukleære leukocytter (mindre enn 10% sammenlignet med friske kontroller). Fire pasienter hadde unormale resultater i begge testene. Alle pasientene presenterte minst en unormal test og fikk diagnosen sannsynlig X-bundet CGD. Moren og søsteren til pasient T. B. P. presenterte EN NBT-lysbildetest som var kompatibel med bærestatusen Til X-linked CGD. I løpet av studieperioden døde en pasient (Gm) av lungebetennelse.
vi undersøkte deretter den endelige diagnosen X-koblet CGD VED RT-PCR-analyse av gp91-phox – genuttrykk. RESULTATENE AV RT-PCR-forsterkning med tre sett overlappende primere er presentert i Tabell 2. Kvaliteten på mRNA-prøven ble kontrollert VED PCR-forsterkning av ß-actin, en konstitutiv genkontroll. De forventede normale produktene ble oppnådd i dette tilfellet(Figur 1, 2 og 3).
i fire tilfeller var DET mulig å matche RT-PCR-data med tilgjengelig mutasjonsanalyse, presentert andre Steder av Patiñ m.fl .. (30) eller av vår gruppe ( //www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. presenterte En C469®t overgang i exon 5, forutsi en nonsensmutasjon (R157X). Mf presenterte en nonsenssubstitusjon i exon 3, R (arginin) 73-Stopp. R. S. viste en 264 G®en substitusjon ved 3 ‘ splice krysset av gp91-phox exon 3. CDNA-sekvensen viste en sletting av gp91-phox exon 3, noe som ga opphav til en ustabil eller ikke-funksjonell mutant gp91-phox. G. G. presentert en defekt spleising av gp91-phox exon 3(den underliggende mutasjonen er ennå ikke bestemt). De andre pasientene er fortsatt under utredning.
som helhet tillot denne strategien påvisning av defekt gp91-phox-uttrykk hos syv av åtte pasienter. RT-PCR-resultatene matchet klinisk historie, biokjemiske data (NBT eller superoksydfrigjøringsanalyse) og tilgjengelig mutasjonsanalyse i fire tilfeller. I ytterligere tre tilfeller matchet RT-PCR-resultatene klinisk historie og biokjemiske data. I et annet tilfelle VAR RT-PCR normal til tross for en klinisk historie kompatibel MED CGD, en defekt respiratorisk burst preget av NBT-testen og superoksydfrigjøringsanalysen og NBT-tester av sin mor og søster kompatibel med x-koblet cgd-bærerstatus.
Diskusjon
dette papiret rapporterer om biokjemiske og genuttrykk studier av 8 urelaterte Brasilianske mannlige pasienter med en klinisk historie MED CGD, som ble henvist til vårt laboratorium for detaljert undersøkelse. CGD er en sjelden arvelig lidelse der fagocytiske celler ikke klarer å generere superoksidanion og andre reaktive oksygenformidlere. Vi etablerte i utgangspunktet diagnosen sannsynlig X-bundet CGD ved hjelp av biokjemiske metoder som NBT-lysbildetester og/eller superoksidanionfrigivelsesanalyser. Våre resultater viste at alle pasienter presenterte nedsatt NADPH-oksidasefunksjon og i sin tur sannsynlig X-bundet CGD.
begge metodene bidrar til den sannsynlige diagnosen CGD på forskjellige måter. NBT slide test gir informasjon om antall celler som reduserer NBT til formazan inne i cytoplasma og intensiteten av denne reduksjonen. Dermed viser pasienter med variantformer Av X-bundet CGD unormale NBT-lysbildetester, hvor de fleste cellene svakt reduserer NBT til formazan. NBT-lysbildetesten oppdager også kvinnelige bærere Av X-koblet CGD. Superoksidfrigivelsesanalysen måler reduksjonen av cytokrom c av superoksid produsert av aktiverte leukocytter tilstede i reaksjonen, og tillater diagnose av variantformer Av X-bundet CGD. Begge testene kan enkelt standardiseres i laboratorier med lav kompleksitet og krever heller ikke dyrt utstyr. Dihydrorhodamine 123-testen er en svært sensitiv metode for biokjemisk diagnose AV CGD; det krever imidlertid et flowcytometer, et veldig dyrt instrument.
VI evaluerte gp91-phox-genuttrykk i EBV-transformerte b-lymfocytter fra CGD-pasienter VED RT-PCR-analyse. Spesifikke og overlappende par primere ble brukt til å forsterke tre regioner av gp91-phox-genet VED RT-PCR: eksoner 1-5, 3-9 og 7-13. Denne strategien tillot påvisning av defekt gp91-phox-uttrykk hos 7 av 8 pasienter. RT-PCR-resultatene matchet klinisk historie, biokjemiske data (NBT eller superoksydfrigjøringsanalyse) og tilgjengelig mutasjonsanalyse i fire tilfeller. I ytterligere tre tilfeller matchet RT-PCR-resultatene klinisk historie og biokjemiske data.
gp91-phox – genuttrykk ble redusert i alle eksoniske regioner av Pasient R. B. denne reduksjonen kan være et resultat av mutasjoner som fører til lav rna-stabilitet eller endret transkripsjonell aktivitet. Pasienter G. M. og T. P. viste fraværende ekspresjon av eksoner 7-13, noe som tyder på at redusert ekspresjon av disse ytterligere 3 ‘ – end eksoner kan være et resultat AV rna ustabilitet eller en spleising defekt, f. eks, delvis korrekt spleising å produsere et signal, men delvis unormal spleising å eliminere en primer bindingsstedet, en gjenstand for å bli undersøkt av fremtidige genomisk DNA mutasjon analyser.
Pasient G. G. presenterte en diffus, lav overflod, mindre størrelse produkt av eksoner 1-5 (Figur 1), og fraværende uttrykk for andre eksoniske regioner. Hans mutasjonsanalyse viste en defekt på exon 3-spleisestedet. På samme måte avslørte mutasjonsanalysen av pasient R. S. også en defekt på ekson 3-spleisestedet. I dette tilfellet kan imidlertid ET mindre rikelig PCR-produkt oppdages.
Pasient M. F. presenterte redusert ekspresjon av eksoniske regioner 3-9 og 7-13, som kan være et resultat av defekt transkripsjonsaktivitet i ekson 3. Jem presenterte en nonsensmutasjon i ekson 5 som resulterte i tap av gp91-phox-uttrykk, som vist VED RT-PCR-analyse, en mulig konsekvens av nonsensmediert mRNA-ustabilitet.
i ett tilfelle, pasient T. P. B. gp91-phox genuttrykk var normalt til tross for en familiehistorie kompatibel MED CGD og en defekt respiratorisk burst aktivitet. I dette tilfellet var diagnosen sannsynlig X-bundet CGD basert på unormale NBT-tester i sin mor og søster, kompatibel med bærerstatus. Vi hypoteser at en punktmutasjon, for eksempel en enkelt basesubstitusjon som ikke endrer PCR-fragmentlengde eller overflod, bør undersøkes i dette spesielle tilfellet.
RT-PCR er et kraftig verktøy for å vurdere genuttrykk. Denne egenskapen kan delvis forklare variasjonen av gp91-phox genuttrykk blant pasientene som er inkludert i denne studien, og viktigheten av å kombinere overlappende par primere for å screene hele lengden av meldingen. RT-PCR har blitt brukt i isolerte casestudier som en del av den første diagnosen AV DE forskjellige former FOR CGD (17-22). RT-PCR-analyse var også nyttig i prenatal diagnose AV CGD, som følge av p47-phox mangel (23). Det har imidlertid blitt mer vanlig brukt til studier av genregulering AV NADPH-oksidasekomponentene i en rekke celler (15,16,24-29). Hittil har den potensielle bruken av dette nyttige verktøyet for å etablere den endelige diagnosen X-bundet CGD, den hyppigste formen, ikke blitt undersøkt grundig. Videre studier bør utføres for å sammenligne sensitiviteten og spesifisiteten til denne testen sammenlignet med andre komplekse analyser som Vestlige eller Nordlige blotter.
Samlet sett har VI vist AT RT-PCR, en enkel og rimelig metodikk, etablerte den endelige diagnosen X-koblet CGD i 7 av 8 tilfeller, uten å måtte bruke komplekse og dyre metoder som Northern blot, slot blot, sscp-analyse eller genomisk DNA-sekvensering. DERMED KAN RT-PCR være et egnet verktøy for å diagnostisere CGD i laboratorier i utviklingsland. Det er svært viktig å bestemme den endelige molekylærgenetiske defekten for å gi riktig genetisk rådgivning og prognose til slektninger med CGD. I tillegg vil molekylærgenetiske studier av det menneskelige NADPH-oksidasesystemet fremme kunnskapen om denne avgjørende og gamle forsvarsmekanismen.
2. Landing BH & Shirkey HS (1957). Et syndrom med tilbakevendende infeksjon og infiltrasjon av viskaret ved pigmenterte lipidhistiocytter. Pediatri, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey R & Stokstad ELR (1975). Effekt av selen i forebygging av eksudativ diatese hos kyllinger. Proceedings Av Samfunnet for Eksperimentell Biologi og Medisin, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Forehand JR, Axtell RA, Roberts rl & Johnston Jr RB (1988). Kliniske egenskaper og nåværende behandling av kronisk granulomatøs sykdom. Hematologi / Onkologi Klinikker I Nord-Amerika, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993). Kronisk granulomatøs sykdom: løsningen av en klinisk gåte på molekylært nivå. Klinisk Immunologi Og Immunopatologi, 67: S2-S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, Brun R, Jesaitis aj & Parkos CA (1987). Glykoproteinet kodet Av x-bundet kronisk granulomatøs sykdomslokus er en komponent i nøytrofil cytokrom b-komplekset. Natur, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi h, Volpp BD, Pearson DW, Nauseef wm & Curnutte JT (1989). Genetiske varianter av kronisk granulomatøs sykdom: Utbredelse av mangler av TO cytosoliske komponenter I NADPH-oksidasesystemet. New England Journal Of Medicine, 321: 647-652.
10. Cross AR, Noack D, Rae J, Curnutte jt & Heyworth PG (2000). Hematologisk viktige mutasjoner: de autosomale recessive former for kronisk granulomatøs sykdom(første oppdatering). Blodceller, Molekyler og Sykdommer, 26: 561-565.
11. Smith rm & Curnutte JT (1991). Molekylær basis for kronisk granulomatøs sykdom. Blod, 77: 673-686.
12. Vowells SJ, Fleisher TA, Sekhsaria S, Alling DW, Maguire TE & Malech HL (1996). Genotypeavhengig variabilitet i flowcytometrisk evaluering av redusert nikotinamid-adenindinukleotidfosfatoksidasefunksjon hos pasienter med kronisk granulomatøs sykdom. Tidsskrift For Pediatri, 128: 104-107.
15. Condino-Neto En & Newburger PE (1998). NADPH-oksidaseaktivitet og cytokrom b558-innhold av humane epstein-Barr-virus-transformerte b-lymfocytter korrelerer med ekspresjon av gener som koder for komponenter i oksidasesystemet. Arkiv For Biokjemi og Biofysikk, 360: 158-164.
16. Condino-Neto En & Newburger PE (2000). Interferon-gamma forbedrer spleisingseffektiviteten av cybb-genutskrifter i en interferon-responsiv variant Av x-bundet kronisk granulomatøs sykdom på grunn av en splice site consensus region mutasjon. Blod, 95: 3548-3554.
19. Bonizzato A, RUSSISK PARLAMENTSMEDLEM, Donini M & Dusi S (1997). Identifikasjon av en dobbel mutasjon (D160V-K161E) i p67phox-genet hos en kronisk granulomatøs sykdomspasient. Biokjemisk Og Biofysisk Forskningskommunikasjon, 231: 861-863.
21. Noack D, Heyworth PG, Newburger PE & Kryss AR (2001). En uvanlig intronisk mutasjon i CYBB-genet som gir opphav til kronisk granulomatøs sykdom. Biochimica et Biophysica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler j, Curnutte jt, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock SJ & Goerlach A (2000). Rekombinasjonshendelser mellom p47-phox-genet og dets svært homologe pseudogener er hovedårsaken til autosomal recessiv kronisk granulomatøs sykdom. Blod, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Fosterdiagnostikk i to familier med autosomal, p47 (phox)-mangelfull kronisk granulomatøs sykdom på grunn av en ny punktmutasjon I NCF1. Prenatal Diagnose, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff S & Bringas P (1999). Utviklingsmessig uttrykk FOR NADPH fagocytisk oksidasekomponenter i musembryoer. Pediatrisk Forskning, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Cutting edge: infeksjon av agent for human granulocytisk ehrlichiosis forhindrer respiratorisk utbrudd ved å nedregulere gp91phox. Tidsskrift For Immunologi, 164: 3946-3949.
26. Bayraktutan U, Blayney L & Shah AM (2000). Molekylær karakterisering og lokalisering AV nad (P)h oksidasekomponentene gp91-phox og p22-phox i endotelceller. Arteriosklerose, Trombose og Vaskulær Biologi, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese Rm, Gallin ji & Lomax KJ (1992). Retroviral ekspresjon av rekombinant p47foksprotein Ved Epstein-Barr-virus-transformerte b-lymfocytter fra en pasient med autosomal kronisk granulomatøs sykdom. Blod, 79: 1829-1835.
28. Gorlach A, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M, Dehghani F & Busse R (2000). EN gp91phox inneholder NADPH oksidase selektivt uttrykt i endotelceller er en viktig kilde til oksygen radikal generasjon i arterieveggen. Sirkulasjonsforskning, 87: 26-32.
29. Rouzaut A, Lopez-Moratalla n & Av Miguel C (2000). Differensial genuttrykk i aktivering og modning av humane monocytter. Arkiv For Biokjemi og Biofysikk, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). NBT slide test: en enkel screeningsmetode for å oppdage kronisk granulomatøs sykdom og kvinnelige bærere. Journal Of Pediatrics, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Isolering av mononukleære celler og granulocytter fra humant blod. Scandinavian Journal Of Clinical And Laboratory Investigation, 21 (Suppl 97): 1-77.
33. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Carneiro-Sampaio mms & Av Nucci G (1993). Nøytrofiler og mononukleære celler fra pasienter med kronisk granulomatøs sykdom frigjør nitrogenoksid. British Journal Of Clinical Pharmacology, 35: 485-490.
35. Kontakt-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio mms & De Nucci G (1996). Effekten av rekombinant human interferon-gamma-terapi på frigjøring av nøytrofile og mononukleære celler fra pasienter med kronisk granulomatøs sykdom. Journal Of Interferon Og Cytokin Forskning, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin ji & Fauci AS (1984). B – cellelinjer som modeller for arvelige fagocytiske sykdommer: superoksidgenerering ved kronisk granulomatøs sykdom og granulater Ved Chediak-Higashi syndrom. Tidsskrift For Immunologi, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Henle W & Henle G (1971). Etablering av lymfoblastoide cellelinjer fra voksen og føtalt humant lymfoidvev og dets avhengighet AV EBV. Internasjonalt Tidsskrift For Kreft, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger PE & Weissman SM (1999). En modifisert metode for visning av 3 ‘ – end restriciton fragmenter av cDNAs: Molekylær profilering av genuttrykk i nøytrofiler. Metoder I Enzymologi, 303: 272-297.
Anerkjennelser
forfatterne takker pasientene og deres familier for å delta og for deres hjelp, og sykepleieren Silvana Severino for teknisk assistanse. Forfatterne takker Også Professor Peter Newburger, University Of Massachusetts Medical School, for en kritisk gjennomgang av dette manuskriptet.
Korrespondanse og Fotnoter