ELISA: Hvordan Analysere Eksperimentelle Resultater

Av Dr. Surat P, Ph. D. Vurdert Av Dr. Tomislav Mešć, MD, Ph. d.

ELISA, Eller Enzymbundet Immunosorbentanalyse, er et verktøy som brukes til å oppdage og kvantifisere stoffer, som peptider, proteiner, antistoffer og hormoner. Det innebærer immobilisering av et antigen eller antistoff på en overflate, etterfulgt av tilsetning av en prøve som skal analyseres. Deteksjon er avhengig av en spesifikk antigen-antistoffreaksjon.

Jarun Ontakrai |

Hva du skal gjøre før DU kjører EN ELISA

En ELISA-test skal alltid utføres i replikater (duplikater eller triplikater) for å oppnå nok antall prøver til å beregne standardavviket og koeffisienten av variasjon. Feilkoeffisienten skal opprettholdes mindre enn 20%. Hvis den beregnede feilen er høy, må feil som oppstår på grunn av pipettering, kontaminering av plater og reagenser, fordampning og/eller temperatur vurderes.

Standardkurve

en standardkurve brukes til å måle konsentrasjonen av prøven. Først tegnes absorpsjonsverdiene for standardkonsentrasjoner (pg/ml). En negativ kurve er også gjort som ikke inneholder noen standard eksempeldata og brukes til å oppdage og måle bakgrunnsstøy. For en nøyaktig måling må denne bakgrunnsverdien trekkes fra standardkurven.

absorbansverdiene for kjent konsentrasjon kan plottes som en positiv kontroll. Konsentrasjonen av målproteinet er avledet ved først å beregne gjennomsnittlig absorbans og deretter bruke standardkurven for å estimere konsentrasjonen.

Fortynningsfaktorer bør også tas i betraktning. For eksempel, hvis prøven er fortynnet fire ganger, bør absorbansen multipliseres med fire før bruk av standardkurven for å utlede konsentrasjonen.

Variasjonskoeffisient

definisjonen av variasjonskoeffisient er forholdet mellom standardavvik og gjennomsnitt – dvs. standardavvik(σ) / gjennomsnitt (µ). Store verdier av variasjonskoeffisient indikerer unøyaktigheter på grunn av pipettering eller blanding av reagenser mellom brønner, bakteriell eller soppforurensning, uttørking av brønner eller temperaturvariasjoner.

Spike recovery

verdien oppnådd etter å ha kjørt ELISA-testen, avhenger av hvordan et målrettet protein interagerer med antistoffene, og denne interaksjonen sammenlignes med en standard proteinkurve. Flere faktorer-inkludert buffer, matrise og heterofile antistoffer – kan påvirke bindingen av prøven, så dette må tas i betraktning ved bestemmelse av nøyaktigheten AV EN ELISA.

en spike-analyse kan utføres for å bestemme nøyaktigheten AV ELISA-resultatene. I denne analysen blir en kjent mengde rekombinant protein tilsatt eller spiket inn i prøven. Deretter måles mengden materiale ved hjelp av standardkurven. Store avvik i de målte verdiene kan indikere feil på grunn av ukjente elementer i analysen.

Linearitetstest

Linearitetstest brukes også til å bestemme nøyaktigheten AV ELISA. I dette tilfellet fortynnes den spikede prøven serielt til 1: 2, 1:4 og 1: 8. Hvis konsentrasjonen av den endrede prøven oppdages, og hvis resultatene ikke viser en lineær endring i målingene, kan det indikere feil i nøyaktigheten AV ELISA.

i noen tilfeller kan feil observeres ved visse konsentrasjoner og ikke lenger observeres ved lavere konsentrasjoner. I slike tilfeller må prøven fortynnes før konsentrasjonsmålinger utføres.

Feilsøking

Bakgrunnsstøy kan skyldes en rekke faktorer, inkludert:

• Utilstrekkelig vasking av brønnene
• Forurensede vaskebuffere
• for mye deteksjonsreagens
• Kryssreaktivitet av antistoffet
• Utfelling av bufferen og/eller analytten

noen ganger kan dårlig standardkurve genereres. Dette kan skyldes feil i standard løsning, nedbrytning av standard, standard er feil rekonstituert, eller hvis kurven ikke passer til skalaen. Med tanke på sistnevnte kan plotting gjøres ved hjelp av forskjellige skalaer, for eksempel log-log eller 5 parameter logistisk kurve.

Videre Lesing

• Alt Innhold Av Enzymbundet Immunosorbentanalyse (ELISA)
• Elisa-Applikasjoner
• Western Blot – Lab-Teknikk Som Brukes Til Å Oppdage Proteiner
• Antistoffapplikasjoner
• Måling Av Genuttrykk

Skrevet av

Dr. Surat P

Dr. Surat uteksaminert Med En Ph. D. i Cellebiologi og Mekanobiologi fra Tata Institute Of Fundamental Research (Mumbai, India) i 2016. Før Hennes Ph. D. studerte Surat For En Bachelor Of Science (B.Sc.) Grad I Zoologi, der hun var mottaker Av En Indisk Academy Of Sciences Summer Fellowship å studere proteiner involvert I AIDs. Hun produserer kronikker om et bredt spekter av emner, som medisinsk etikk, datamanipulering, pseudovitenskap og overtro, utdanning og menneskelig evolusjon. Hun er lidenskapelig opptatt av vitenskapskommunikasjon og skriver artikler som dekker alle områder innen biovitenskap.

Sitater