DISKUSJON
Denne studien gir bevis for at β-celler kan fungere godt i en pode nettstedet uten nærliggende ikke–β-celler. For å studere β-celleberikte transplantater måtte holmer dispergeres i enkeltceller for å tillate fluorescensaktivert cellesortering. Våre innledende studier undersøkte derfor effekten av øyedispersjon og reaggregasjon på transplantasjonsresultat. Når de dispergerte cellene ble reaggregert før transplantasjon, var det nødvendig med færre celler for å reversere hyperglykemi. Etter IPGTTs, reaggregated holmer hadde en glukoseprofil lik vekt matchet ikke-diabetiker, ikke-transplantert kontroll mus. Imidlertid hadde mus transplantert med 2,5 millioner dispergerte øyeceller enda lavere blodsukkernivå etter glukosetoleransetesten. Dette funnet indikerer at transplantasjon av dispergerte øyceller kan være effektiv, forutsatt at tilstrekkelig antall transplanteres. Men hvis øyceller reaggregeres før transplantasjon, kan halvparten av antall celler gjenopprette normoglykemi. Disse resultatene er i tråd med flere tidligere studier som har vist at insulinsekretoriske responser reduseres i dispergerte øyeceller og forbedres ved reaggregering av cellene (24-27). Dette overlegne resultatet kan skyldes en positiv påvirkning av cellekommunikasjon på insulinsekresjon og reiser spørsmål om aggregerte celler er mer resistente mot apoptose. Det er sannsynlig at dispergerte celler dannet klynger in vivo etter transplantasjon, men dette kan skje etter at mange celler går tapt i de første dagene etter transplantasjon. Oppsummert er det tydelig at større antall dispergerte celler i utgangspunktet kreves for å reversere hyperglykemi.
i vår neste studie ble dispergerte øyeceller beriket for β-celler ved bruk av fluorescerende aktivert cellesortering. β-Celler ble sortert i henhold til deres endogene fluorescens og forward scatter (størrelse), som tidligere beskrevet (19-21). Ved hjelp av denne teknikken var vi i stand til å oppnå cellepopulasjoner av ∼95% β-celler. Disse β-celleberikte fraksjonene ble deretter reaggregert før transplantasjon. Mus som hadde blitt transplantert med β-celleberikte aggregater hadde en rask reversering av hyperglykemi på samme måte som mus transplantert med et tilsvarende volum av hele holmer. Det bør bemerkes at antall β-celler ville ha vært lavere ved øyetransplantasjoner sammenlignet med β-celletransplantasjoner. Det er sannsynlig at β-celletransplantasjoner, med 95% β-cellerenhet, inneholdt ∼20% flere β-celler enn på holmene. Målet med studien var imidlertid å fastslå om rensede β-celler, transplantert i volumer som ligner de som brukes ved øyetransplantasjon, kunne reversere diabetes og å fastslå om β-celler avledet fra stamceller noen gang kunne være nyttige for transplantasjon til diabetespasienter. I glukosetoleransetester 4 uker etter transplantasjon hadde mus som ble transplantert med β-celleberikte aggregater, noe lavere blodsukkernivå og hadde en tendens til å ha litt høyere insulinnivåer enn de som ble transplantert med holmer. Etter 12 uker var det imidlertid ingen forskjell mellom disse gruppene med hensyn til glukosetoleranse, insulinnivåer eller graftinsulininnhold. I denne eksperimentelle serien ble de nondiabetiske, ikke-transplanterte kontrollmusene alder matchet i stedet for vekt matchet. Mens vektene til de transplanterte musene hadde holdt seg stabile eller falt i løpet av diabetesperioden, fortsatte kontrollmusene å gå opp i vekt gjennom hele studien. Deres dårlige glukosetoleranse og høyere insulinnivåer tyder på at disse kontrollmusene hadde blitt insulinresistente. I tillegg kan de lavere glukosenivåene hos de transplanterte musene forklares ved at rotteøyene ble implantert, fordi rotter vanligvis har lavere glukosenivåer enn mus og kan ha et lavere settpunkt for glukosestimulert insulinsekresjon.
disse resultatene viser at transplantasjonsresultatet av β-celleberikte aggregater ligner på holmer. Transplantasjon av en renset populasjon av β-celler har tidligere blitt vist Av Keymeulen et al. (28) for å lykkes, selv om det i denne studien ble foreslått at blanding av endokrine ikke–β-celler med β-celler før transplantasjon bedret transplantasjonsfunksjonen. I Keymeulen-studien ble graftene studert i 64 uker i stedet for 12-ukene i denne studien. Deres rotte β – celletransplantater og blandede transplantater av rotte β-celler pluss rotte endokrine ikke-β-celler fungerte bra hos rotter til ∼20 uker, da noen av transplantatene begynte å svikte. Innen 64 uker hadde alle transplantater, uavhengig av om de inneholdt rensede β-celler eller β-celler blandet med andre endokrine ikke–β-celler, helt eller delvis sviktet. Imidlertid implanterte de ca 1,2 – 1,7 millioner β-celler i rotter, noe som kunne betraktes som en minimal massemodell. Denne grundige studien viste også at β-celler fra eldre rottegivere ikke fungerer så vel som β-celler fra yngre rottegivere. Keymeulen-studien kompletterer dermed funnene i denne studien ved at begge viser imponerende funksjon av transplantater som består av rensede β. En annen celletype innen holmer som potensielt kan bidra til utfallet av transplantasjon er endotelcellen, som er rapportert å bidra til revaskularisering av transplanterte holmer (15,16). Det er imidlertid ikke klart at det er nok av disse cellene til å gi et meningsfylt bidrag. Likevel er det tydelig fra de nåværende studiene at selv om endokrine ikke-β-celler og donorendotel kan være gunstig for funksjonen av transplanterte øyetransplantater, ser de ikke ut til å være avgjørende for vellykket transplantasjon. Dette funnet indikerer at β-celler avledet in vitro fra stamceller eller en annen kilde kan være svært nyttige for transplantasjonsformål.
da graftsammensetningen ble studert 12 uker etter transplantasjonen, hadde de β-celleberikte aggregatene tilnærmet samme 5% av ikke–β–celler i transplantatene som ved de første preparatene. Selv om dette ikke var overraskende, var det bemerkelsesverdig å finne at holmer som i utgangspunktet hadde 25% ikke-β-celler hadde bare 5% i graftene. De aller fleste av disse cellene er glukagonholdige α-celler. Dersom de β-celleberikte transplantatene hadde mistet ikke–β-celler i samme grad som holm–transplantatene, ville man ha forventet at de bare hadde 1% av ikke-β-celler etter transplantasjonen. Det er også interessant at tapet av ikke–β-celler i holm–transplantatene syntes å stoppe ved 5%, noe som var den samme prosentandelen av ikke-β-celler som ble funnet i ③ –celleberikte transplantater. I tråd med disse funnene fant vi også at når umodne neonatale porcine pankreascelleklynger ble transplantert til nakne mus, var transplantatene mange måneder senere ∼95% β-celler (29). Dette fenomenet av de nåværende forsøkene med rotteøyer kan forklares med fortrinnsrett død av de ikke-β-cellene som beskrevet før (30-33). Disse studiene og våre egne konkluderer med at nedgangen hovedsakelig skyldes glukagonproduserende celler (30-33). Vi vet ikke om δ-celler og PP-celler også forsvinner. Perifer lokalisering av α-celler i gnagerøyer kan potensielt gjøre dem mer sårbare for skade under isolasjonen. Selv om vi ikke har studert dette i detalj i denne studien, har tidligere studier vist at dette ikke er hovedårsaken til α-celletap etter transplantasjon. I en studie Av Lau et al. (33) holmer som ble implantert i leveren hadde mistet α-celler 4 uker etter transplantasjon, mens holmer som ble implantert i nyre fra samme isolasjon ikke hadde det, noe som indikerte at isolasjonsrelaterte hendelser ikke hadde forårsaket tap av disse perifere cellene (33). I den studien viste intraportale holmer som ble implantert, tap av α-celler, mens holmer som ble implantert under nyrekapselen, ikke viste tap av α-celler. I den foreliggende studien så vi tap av ikke-β-celler i holmer under nyrekapselen 1 uke etter implantasjon. En forskjell mellom studien og denne studien er at de implanterte øyer i normoglykemiske rotter, mens mottakerne i denne studien var hyperglykemiske mus. Det er mulig at forskjeller i metabolsk belastning på øyetransplantatet kan påvirke overlevelsen av α-celler. Det kan ikke utelukkes at α-celletap er raskere i leverområdet, Som Lau et al. (33) rapportert. Gunther et al. (31) rapporterte tap av α-celler så tidlig som 2 dager etter implantasjon i leveren av diabetiske rotter (31). Fordi normale nivåer av glukagon og andre ikke–β-cellederiverte peptider fremdeles produseres av den endogene bukspyttkjertelen, er det mulig at ikke–β–cellene i transplantatene forsvinner på grunn av involusjon for å forhindre hyperglukagonemi.
det hypotetiske spørsmålet, som en dag kan være av praktisk betydning, er om en graft av rene β-celler ville gi et tilstrekkelig transplantasjonsresultat. Når det gjelder hele kroppens metabolske effekter av glukagonsekresjon fra transplantater, ser det ut til at sekresjon fra transplantater gir minimal beskyttelse mot akutt hypoglykemi (34), men humane øyetransplantasjoner kan opprettholde nær normale glukosenivåer. Den vedvarende glukagonsekresjonen fra bukspyttkjertelen kan gi noe bidrag til glukosehomeostase, men igjen, liten beskyttelse mot akutt hypoglykemi. Disse mangelfulle glukagonresponsene kan gjøre mottakerne mer utsatt for hypoglykemi under trening (35,36), men dette er usannsynlig å oppveie fordelene. Det neste spørsmålet er om det er noen viktig lokal påvirkning av holmer ikke–β-celler på β-cellefunksjon. Tatt i betraktning mikrovaskulær anatomi på holmen og de fysiologiske forsøkene som viser at ikke-β-celler er nedstrøms for β-celler (13,14), ser det ut til at de fleste β–celler ikke påvirkes av ikke-β-celler. Noe innsikt kan gis av våre målinger som fastslår hvor langt β-celler var borte fra ikke–β-celler. Da vi kvantifiserte antall β-celler som var i nærheten av en ikke–β-celle, ble det funnet at 65-75% av β-celler var 50 µ fra en ikke–β-celle. Det virker usannsynlig at lokal sekresjon fra ikke-β-celler kan ha mye parakrinpåvirkning på den avstanden. Videre, fra studier av andre (37,38), vet vi at mikrovaskulaturen til transplanterte øyer er svært forskjellig fra normal. Dermed er anatomien til øyetransplantater svært forskjellig fra øyer i bukspyttkjertelen, men disse transplantatene er fortsatt effektive for å reversere hyperglykemi hos diabetespasienter.
avslutningsvis fant vi at β-celleberikte aggregater effektivt kan reversere hyperglykemi hos mus, og at transplanterte intakte holmer er utarmet i ikke-β-celler. Det er derfor sannsynlig at ikke–β-celler fra holmer ikke er avgjørende for vellykket øyetransplantasjon.