ELISA: het Analyseren van Experimentele Resultaten

Door Dr. Surat P, D. Ph. Beoordeeld door Dr. Tomislav Meštrović, MD, D. Ph.

ELISA, of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, is een tool voor het detecteren en kwantificeren van stoffen, zoals peptiden, eiwitten, antilichamen en hormonen. Het impliceert de immobilisatie van een antigeen of antilichaam op een oppervlakte, gevolgd door de toevoeging van een te analyseren steekproef. De opsporing is afhankelijk van een specifieke antigeen-antilichaamreactie.

Jarun Ontakrai /

wat moet worden gedaan voordat een ELISA

wordt uitgevoerd een ELISA-test moet altijd worden uitgevoerd in duplicaten (duplicaten of triplicaten) om een voldoende aantal monsters te verkrijgen om de standaardafwijking en variatiecoëfficiënt te berekenen. De foutencoëfficiënt moet lager zijn dan 20%. Als de berekende Fout hoog is, moeten fouten als gevolg van pipetteren, contaminatie van platen en reagentia, verdamping en/of temperatuur worden beoordeeld.

standaardcurve

een standaardcurve wordt gebruikt om de concentratie van het monster te meten. Eerst worden de absorptiewaarden van standaardconcentraties (pg/ml) uitgezet. Een negatieve curve wordt ook gedaan die geen standaard steekproefgegevens bevat en wordt gebruikt om achtergrondruis te detecteren en te meten. Voor een nauwkeurige meting moet deze achtergrondwaarde van de standaardkromme worden afgetrokken.

de absorptiewaarden van de bekende concentratie kunnen worden uitgezet als een positieve controle. De concentratie van de doelproteã ne wordt afgeleid door eerst de gemiddelde absorptie te berekenen en dan de standaardkromme te gebruiken om de concentratie te schatten.

er moet ook rekening worden gehouden met Verdunningsfactoren. Als het monster bijvoorbeeld viervoudig is verdund, moet de extinctie met vier worden vermenigvuldigd voordat de standaardcurve wordt gebruikt om de concentratie af te leiden.

variatiecoëfficiënt

de definitie van variatiecoëfficiënt is de verhouding tussen standaardafwijking en gemiddelde – d.w.z. standaardafwijking (σ)/gemiddelde (µ). Grote waarden van variatiecoëfficiënt geeft onnauwkeurigheden als gevolg van pipetteren of mengen van reagentia tussen putten, bacteriële of schimmel verontreiniging, uitdroging van putten, of temperatuurschommelingen.

Spike recovery

de waarde die wordt verkregen na het uitvoeren van de ELISA-test hangt af van de interactie van een bepaald eiwit met de antilichamen, en deze interactie wordt vergeleken met een standaard eiwitcurve. Verschillende factoren – waaronder buffer, matrix en heterofiele antilichamen – kunnen de binding van het monster beïnvloeden, dus hiermee moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de nauwkeurigheid van een ELISA.

een spike-test kan worden uitgevoerd om de nauwkeurigheid van ELISA-resultaten te bepalen. In deze analyse wordt een bekende hoeveelheid recombinant eiwit toegevoegd of aan het monster toegevoegd. Vervolgens wordt met behulp van de standaardcurve de hoeveelheid materiaal gemeten. Grote afwijkingen in de gemeten waarden kunnen wijzen op fouten als gevolg van onbekende elementen in de assay.

lineariteit assay

lineariteit assay wordt ook gebruikt om de nauwkeurigheid van ELISA te bepalen. In dit geval wordt het “verrijkte Monster” achtereenvolgens verdund tot 1:2, 1:4 en 1:8. Als de concentratie van het gewijzigde monster wordt gedetecteerd en als de resultaten geen lineaire verandering in de metingen vertonen, kan dit wijzen op fouten in de nauwkeurigheid van ELISA.

in sommige gevallen kunnen fouten worden waargenomen bij bepaalde concentraties en niet meer bij lagere concentraties. In dergelijke gevallen kan het nodig zijn het monster te verdunnen voordat de concentratiemetingen worden uitgevoerd.

problemen oplossen

achtergrondgeluid kan worden veroorzaakt door een aantal factoren, waaronder:

• onvoldoende wassen van de putjes
• Verontreinigde wasbuffers
• te veel detectiereagens
• kruisreactiviteit van het antilichaam
• precipitatie van de buffer en/of analyt

soms kan een slechte standaardcurve worden gegenereerd. Dit kan te wijten zijn aan fouten in de standaardoplossing, degradatie van de standaard, de standaard is onjuist gereconstitueerd, of als de curve niet past bij de schaal. Gezien het laatste, plotten kan worden gedaan met behulp van verschillende schalen, zoals log-log of 5 parameter logistic curve.

Verder Lezen

• Alle Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Content
• ELISA Toepassingen
• Western Blot – Lab Techniek Gebruikt voor het Detecteren van Eiwitten
• Antilichaam Toepassingen
• de genexpressie te Meten

Geschreven door

Dr. Surat P

Dr. Surat afgestudeerd met een D. Ph. in celbiologie en Mechanobiologie van het Tata Instituut voor fundamenteel onderzoek (Mumbai, India) in 2016. Voorafgaand aan haar Ph. D., Surat studeerde voor een Bachelor of Science (B.Sc.) graad in zoölogie, waarbij ze de ontvanger was van een Indian Academy of Sciences Summer Fellowship om de eiwitten te bestuderen die betrokken zijn bij AIDs. Ze produceert artikelen over een breed scala aan onderwerpen, zoals medische ethiek, datamanipulatie, pseudowetenschap en bijgeloof, onderwijs en menselijke evolutie. Ze is gepassioneerd door wetenschapscommunicatie en schrijft artikelen over alle gebieden van de life sciences.

citaten