PMC

HCV RNA kwantificering.

het doel van deze studie was het ontwikkelen van een eenvoudige, real-time QRT-PCR assay voor de kwantificering van HCV RNA in zowel serum-als levermonsters met SYBR Green I detectie in plaats van het gebruik van geëtiketteerde probes. Realtime QRT-PCR-tests werden uitgevoerd met een Lichtcycler (Roche) met zowel enkelvoudige amplificatie als een nieuwe beperkte-cyclus geneste amplificatie. RNA-standaarden werden getranscribeerd met T7-polymerase uit amplicons afgeleid van 5′ onvertaalde regio PCR-producten gekloond in Pgem-T Easy (Promega) en tweemaal behandeld met RQ1 DNase. RNA werd gekwantificeerd door spectrofotometrie. Voor een enkele-ronde kwantificering van serummonsters werd RNA omgekeerd getranscribeerd zoals eerder beschreven (7). Voor de kwantificering van PCR met beperkte cyclus werd een RT-PCR uitgevoerd in een éénstapsreactie met 15 PCR-cycli (de stap met beperkte cyclus), gevolgd door een realtime QRT-PCR. De HCV-belasting werd gemeten door middel van real-time PCR met buitenprimers KY78 en KY80 voor enkelvoudige reacties (21) of buitenprimers plus binnenprimers hep21b en hep22 voor geneste reacties met beperkte cyclus (19). De reactiemengsels omvatten 2 µl Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche), 4 mM MgCl2, een concentratie van 0,5 µM van elke primer en 2 µl van de template in een totaal volume van 20 µl. Na incubaties gedurende 10 minuten bij 95°C, werd de Lichtcycler PCR uitgevoerd gedurende 40 cycli, elke cyclus bestaande uit 15 s bij 95°C, gloeien bij 60°C gedurende 5 s, en verlenging bij 72°C gedurende 10 s. De fluorescentie werd gecontroleerd bij 530 nm, en de specificiteit van het signaal werd gecontroleerd door smeltkrommeanalyse.

met synthetisch HCV-RNA als sjabloon was de gevoeligheid van de enkelvoudige realtime QRT-PCR-test ongeveer 103 HCV-kopieën/reactie of 5 × 104 kopieën/ml wanneer de verdunningsfactor werd berekend. Er werd een breed lineair verband waargenomen (tot 6,5 × 108 kopieën/reactie) tussen het aantal PCR-cycli dat nodig is om een fluorescentiesignaal te detecteren en het aantal HCV-kopieën. We hebben de serum viral loads gemeten van 24 patiënten die chronisch geïnfecteerd zijn met verschillende HCV genotypes die voorkomen in Australië (1a, 1b, 2a, 2b, 2c en 3a) (6). Drie patiënten hadden een virale last onder de gevoeligheid van deze versie van de test (5 × 104 kopieën/ml), hoewel ze positief waren door een kwalitatieve in-house geneste RT-PCR-test (19). De overige 21 patiënten hadden een virale last die varieerde van 2,8 × 105 tot 9,1 × 106 kopieën / ml. Om de gevoeligheid en specificiteit van de analyse te verhogen, werd een 15-cyclus, één-stap RT-PCR geïntroduceerd met een daaropvolgende real-time kwantitatieve PCR voor de tweede ronde. Met synthetisch RNA, was de gewijzigde methode in staat om een brede waaier van HCV kopieeraantallen (van 28 aan 2.8 × 106 HCV kopieën/reactie) te ontdekken met behoud van lineariteit. De gevoeligheid van de QRT-PCR-test met beperkte cyclus was groter dan 28 kopieën/reactie (of 1.400 kopieën/ml), wat ongeveer 40 keer groter was dan die van de QRT-PCR-test met één ronde cyclus. De gevoeligheid van deze test is gunstig vergeleken met die van de eerder gerapporteerde methoden waarbij gebruik werd gemaakt van real-time kwantificering met TaqMan-technologie (Roche) en een ABI-Prism 7700-sequentiedetectiesysteem (Perkin-Elmer), die gevoeligheden van 10 kopieën/reactie (9, 16) en 1000 kopieën/reactie (12) hebben gemeld. De gevoeligheid van de detectie van Lichtcycler (Roche) en SYBR Green I is ook gemeld als 10 kopieën/reactie (10). Om deze versie van de test verder te valideren, varieerden de virale ladingen van 16 HCV-positieve serummonsters van 1 × 103 tot 1.2 × 106 kopieën / ml (zoals bepaald met de amplicor Monitor assay) bleek nauw te correleren met de resultaten verkregen met de geneste real-time QRT-PCR assay (r= 0,876, P < 0,0001, N = 16) (Fig. (Fig.11).

HCV repliceert in de lever, maar weinig studies hebben geprobeerd om virale ladingen in de lever te relateren aan klinische resultaten, de voorkeur aan de voorspellende waarde van serum virale ladingen te onderzoeken. Dit laatste zou als een geschikt surrogaat voor virale hepatische ladingen kunnen worden beschouwd indien werd aangetoond dat deze correleren, maar weinig studies hebben dit aangetoond en de tot op heden gerapporteerde resultaten zijn niet overtuigend. De QRT-PCR-test met beperkte cyclus werd daarom gebruikt om de hepatische HCV-belasting te meten. De voor de analyse gebruikte hoeveelheid leverweefsel woog tussen 0,8 en 8,1 mg (gemiddelde = 3.88 ± 2,1 mg), waaruit 2,1 tot 12,9 µg (gemiddelde = 6,62 ± 3,1 µg) RNA werd geëxtraheerd. De opbrengst van totaal RNA bedroeg gemiddeld 1,71 × 103 µg / g leverweefsel, een waarde die vergelijkbaar is met die gevonden in een eerdere studie van 1,01 × 103 µg RNA/g (13). De virale hepatische belasting varieerde van 3,0 × 102 tot 1,3 × 106 HCV RNA-moleculen/µg totaal RNA en het gemiddelde was 2,38 × 105 ± 3,55 × 105 kopieën/µg RNA. Er is een correlatie aangetoond tussen de virale last in de lever, gemeten in termen van het aantal HCV kopieën per microgram totaal RNA, en de virale last in het serum, gemeten met de amplicor Monitor assay, hoewel deze zwak was (r = 0,417, n = 20) (13). Andere studies hebben aangetoond dat de HCV RNA-belasting in het serum aanzienlijk wordt weerspiegeld door de hoeveelheid virus in de lever zonder correlatiecoëfficiënten (3, 8). Hier rapporteren we voor het eerst een statistisch significante correlatie tussen hepatische en serum viral load metingen (r = 0,689, P = 0.004, n = 15), wat aangeeft dat de viremie in feite de hoeveelheid virus in de lever weerspiegelt (Fig. (Fig.22).

in eerdere studies werden metingen van de virale last van de lever uitgedrukt als het aantal kopieën per milligram leverweefsel of het aantal kopieën per microgram totaal RNA. In deze studie tonen we aan dat beide eenheden geschikt lijken, aangezien er een significante correlatie was tussen de virale belasting gemeten in termen van het aantal kopieën per milligram leverweefsel en die gemeten als het aantal kopieën per microgram totaal RNA (r = 0,937, P < 0,0001, n = 20) (Fig. (Fig.3).3). Deze resultaten komen overeen met die van de Moliner et al. (3), die ook een nauwe correlatie heeft aangetoond tussen de virale belasting in de lever, uitgedrukt als het aantal kopieën per gram weefsel, en het aantal kopieën per microgram totaal cellulair RNA (r = 0,85) (3). Het gemiddelde aantal HCV RNA-moleculen per gram leverweefsel was 2,1 × 108 ± 3,71 × 108, ongeveer 170 maal hoger dan de RNA-waarden in serum (1,22 × 106 ± 2,0 × 106 kopieën/ml). Deze bevinding is vergelijkbaar met die van Terrault et al. (18), die aantoonde dat de verhouding van HCV RNA in de lever tot die in het serum 103:1 was. In tegenstelling, McGuiness et al. (13) bleek dat het gehalte in leverweefsel met een factor >104 hoger was. Dit verschil kan verband houden met het feit dat de virale last in de lever van de patiënten in de vorige studie, die voornamelijk een gevorderde HCV-infectie hadden, ongeveer acht keer hoger was (1,83 × 106 ± 0,75 × 106 kopieën/µg RNA) dan in de huidige studie (2,38 × 105 ± 3,55 × 105 kopieën/µg RNA).

concluderend is de real-time QRT-PCR-test een gevoelige, nauwkeurige en betrouwbare methode voor het controleren van HCV-ladingen in zowel serum-als levermonsters.