O isolamento e a longo prazo, a expansão de células primárias, particularmente tronco/progenitoras populações, são fundamentais e importantes técnicas básicas em vários biológica campos, incluindo a biologia do desenvolvimento e a biologia de células estaminais, e a ciência médica. As células em tecidos epiteliais estratificados e colunares são altamente regenerativas e desproporcionalmente responsáveis por muitos cancros humanos; no entanto, a clonagem de células estaminais adultas é limitada por dificuldades na manutenção destas células em um estado imaturo. Nos últimos anos, inovações técnicas resultaram em progressos rápidos e dramáticos na biologia das células estaminais, tais como o uso de pequenas moléculas e fatores de crescimento para imitar ambientes de nicho de tecido e facilitar a “cultura organoide” .
em 1975, Rheinwald e Green estabeleceram o primeiro exemplo bem sucedido de cultura de células estaminais humanas adultas usando queratinócitos humanos . Especificamente, mantiveram queratinócitos humanos a longo prazo em combinação com uma linha celular de fibroblastos de ratinho, 3T3-J2, sub-letalmente irradiada. Embora eles não tenham usado o termo “células estaminais” para queratinócitos clonados cultivados em 3T3 células, verde e colegas encontraram colônias com a notável capacidade de dividir e formar novas colônias após a passagem, que eles denominaram “Holoclones” . Estes holoclones consistem em células pequenas e imaturas que exibiam coloração Nuclear intensa com p63, um regulador mestre da stemness, em células epiteliais estratificadas . No epitélio estratificado, incluindo pele, bronquia pulmonar, glândula mamária e urotélio da bexiga, a população de células estaminais foi localizada principalmente na camada basal, e as células imaturas foram manchadas com p63, consistente com os estudos in vitro . Significativamente, queratinócitos humanos isolados e expandidos de pele autóloga foram enxertados com sucesso em pacientes queimados e regeneraram uma epiderme permanente semelhante ao resultado de enxertos de pele de espessura dividida . Notavelmente, o mesmo procedimento foi aplicado para isolar e expandir as células epiteliais da córnea humana para transplante . Embora esta tecnologia fosse limitada a células-tronco na epiderme e córnea na época, Green e colegas criaram a Fundação para a clonagem de células-tronco humanas adultas nos campos da biologia básica e da medicina regenerativa.
neste artigo de revisão, nós fornecemos uma visão geral do progresso recente da pesquisa e acumulando evidências de um sistema de cultura celular que levou a avanços técnicos em tecnologias de células epiteliais. Novas estratégias de cultura, tanto para as células epiteliais estratificadas como para as células epiteliais colunares, permitiram recapitular o desenvolvimento epitelial humano e podem ser utilizadas para gerar um modelo de doença humana in vitro. Também discutimos o potencial e possíveis aplicações de tecnologias de cultura de células epiteliais normais para medicina regenerativa e destacamos um sistema de cultura de células cancerígenas que reproduz fenótipos individuais de pacientes.
cultura de células epiteliais estratificadas
em tecidos epiteliais estratificados, incluindo epitélio glandular e pseudostratificado, células p63+, que estão localizadas na membrana basilar, podem auto-renovar-se para manter populações de células estaminais/progenitoras e dar origem a descendência que formam tecidos funcionais . Como mencionado acima, a clonagem e expansão de células estaminais epiteliais, tais como queratinócitos da pele e células epiteliais da córnea, foram bem estabelecidas em sistemas de co-cultura com fibroblastos do rato 3T3-J2 irradiados. No entanto, este protocolo padrão tem sido em grande parte limitado à cultura de longo prazo de queratinócitos e células da córnea. No entanto, foram relatadas células estaminais clonadas a partir de epitélios tímicos, assim como o isolamento de células estaminais epiteliais tímicas a partir de diversas espécies, incluindo células humanas, cultivadas com um sistema de alimentação 3T3 . Além disso, Frey e colegas recentemente aplicaram o método de alimentador 3T3 para isolar as células-tronco uroteliais que expressavam o ouriço sônico e residiam na camada basal do urotélio da bexiga . Estas células estaminais uroteliais provenientes de tecidos humanos e suínos isolados foram cultivadas de forma estável numa camada alimentadora 3T3 e foram capazes de dar origem a várias linhagens celulares, incluindo células P63+ basais e células Uroplakinas 2+ e 3+ uroteliais, após transplante de cápsulas renais em ratinhos nus. Em 2011, Pooja et al. explorou o sistema de cultura 3T3 para isolar três tipos de células estaminais epiteliais das vias aéreas humanas., células estaminais nasais, traqueais e distais das vias aéreas, e descobriram que estas células estaminais epiteliais das vias aéreas exibiam fenótipos celulares distintos após diferenciação in vitro, embora os clones imaturos das células estaminais parecessem ser morfologicamente indistinguíveis(Fig. 1) . Num estudo de seguimento, o transplante de células estaminais epiteliais epiteliais da traqueia e das vias aéreas distais do Ratinho demonstrou que as células estaminais das vias aéreas distais foram prontamente incorporadas no tecido pulmonar danificado pelo vírus da gripe H1N1 e diferenciadas em múltiplos tipos de células epiteliais, ou seja, células estaminais distais.* bronquíolos e alvéolos, enquanto as células estaminais da traqueia transplantadas foram localizadas apenas nas vias aéreas principais . Células estaminais clonogénicas também foram isoladas a partir de amostras endoscópicas de biopsia do esófago humano, e estas células foram capazes de formar estruturas epiteliais bem diferenciadas e estratificadas num sistema de cultura de interface líquida do ar (ALI).
Schematic of the cell culture process for human stratified and columnar epitelial stem cells on a 3T3 mouse feeder layer. Para células estaminais epiteliais estratificadas, elas são isoladas a partir de biopsia ou amostras cirúrgicas são banhadas em uma camada 3T3 para uma cultura de longo prazo. Para as células estaminais epiteliais colunares, elas são revestidas em uma camada 3T3 com fatores definidos que são essenciais para o crescimento e manutenção das células estaminais. Colónias morfologicamente imaturas (colónias embaladas com pequenas células) de células estaminais epiteliais são captadas mecanicamente para uma maior expansão homogénea. No ALI cultura, as células sofrem diferenciação e maturação tipos de células em um Transwell
Schlegel e colegas relataram que um centro de exposições Rho-associado da proteína quinase (ROCK) inibidor em combinação com 3T3 alimentador de células aumentou significativamente a capacidade proliferativa do epitélio de células-tronco, incluindo humanos, queratinócitos, células da próstata e glândula mamária células, e que chamou esse fenômeno de “condicional reprogramação” . A capacidade de gerar eficientemente culturas de células estaminais epiteliais a partir de pacientes fornece insights críticos e valiosos sobre diagnósticos baseados em células e terapêuticos . Mais recentemente, Rajagopal e colegas mostraram que a via de sinalização TGFß/BMP/SMAD é importante em vários tecidos epiteliais, incluindo pele derivada de ectodermia e tecido mamário, esôfago derivado de endodermia e tecido da próstata, e epidídimo derivado de mesodermia. Eles descobriram que a inibição dual da sinalização SMAD (o sinal BMP foi bloqueado por DMH-1 e o sinal TGFß foi inibido por a-83-01) facilitou a propagação estável das populações de células basais epiteliais humanas e de ratinhos. Surpreendentemente, a inibição dual TGFß/BMP permitiu a expansão robusta das células estaminais epiteliais sem a necessidade de células alimentadoras 3T3 do rato.Estes avanços técnicos, em combinação com pequenas moléculas e células alimentadoras, podem ser usados para expandir de forma contínua e eficiente populações epiteliais estratificadas, in vitro. Outro avanço na cultura epitelial estratificada, a cultura organoide, tem sido utilizado para expandir tanto os progenitores da próstata humana basal e luminal. Estes progenitores humanos do lúmulo foram multipotentes e formaram estruturas semelhantes às da próstata in vitro . No entanto, a geração de estruturas tridimensionais consistindo de epitélios estratificados ou pseudoestratificados para recapitular a autêntica arquitetura in vivo permanece um desafio, embora muitos pesquisadores tenham relatado culturas esferóides e organóides. Este problema pode ser resolvido através do estabelecimento de um método para facilitar a auto-organização, como realizado em tecidos derivados de células estaminais pluripotentes .
epiteliais Colunares cultura de células
Embora intestinal de células-tronco possuem a notável capacidade de proliferar em uma alta taxa de rotatividade para manter intestinal epithelia, e hepatócitos são altamente regenerativa em resposta ao dano, a capacidade de clone de células-tronco populações de células epiteliais colunares é severamente limitada, presumivelmente devido à falta de tecido nicho de sinais in vitro. Ao longo da última década, Clevers e os colegas descobriram LGR5 (leucina-rich repeat-contém proteína G acoplada receptor 5), um intestinal de células-tronco marcador, em um sofisticado modelo de mouse (Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 ratos cruzou-se com o Cre-ativado Rosa26 repórter LacZ) e estabeleceu o mouse intestinal organoid cultura, método que consiste em vilosidades-estruturas e cripta-como as zonas com vários intestinal tipos de células . Em combinação com factores de crescimento e coquetéis de moléculas pequenas, uma fracção isolada das células estaminais LGR5+ foi suspensa em Matrigel e cultivada a longo prazo . Modificando a condição da cultura com a utilização de nicotinamida, um inibidor do receptor p38 e TGFß, as células epiteliais humanas isoladas do intestino delgado e do cólon foram capazes de expandir infinitamente in vitro a longo prazo . Esta técnica é aplicável à cultura de outros tipos de células , tais como células do ducto pancreático e hepatócitos, e facilitou avanços revolucionários na cultura de células epiteliais colunares.
a cultura organoide emprega uma plataforma de cultura 3D baseada em Matrigel e pode ser extensivamente utilizada para a cultura estável de diversos tipos de células epiteliais adultas, incluindo células epiteliais estratificadas, com populações de células estaminais/progenitoras . No entanto, a capacidade de propagar rápida e eficientemente uma fracção de células estaminais uniformes in vitro também é útil e importante para o estudo detalhado da auto-renovação e especificação do destino em células estaminais tecidulares e possíveis aplicações futuras de transplantação de células para medicina regenerativa. Xian e colegas desenvolveram recentemente um novo sistema de cultura para a expansão homogênea das células estaminais intestinais humanas, incluindo as células do intestino delgado e do cólon. Este sistema empregou uma camada alimentadora de 3T3 do rato em combinação com factores de crescimento e inibidores da Via do sinal para expandir robustamente as células estaminais epiteliais colunares humanas (Fig. 1) . Além disso, mais de 50% das células estaminais intestinais cultivadas com 3T3 fibroblastos foram capazes de formar colónias. No intestino dos mamíferos, fatores de nicho definidos, tais como sinais de Wnt e entalhe, são essenciais para governar a stemness das células estaminais intestinais na base cripta. Além disso, as células Paneth, que também estão localizadas na base da cripta, surgem de células estaminais e agem como o nicho de células estaminais, fornecendo fatores essenciais de uma forma paracrina. Como as culturas organóides consistem em células estaminais e vários derivados, tais como células Paneth, fatores de nicho são fornecidos autonomamente . Em contraste, como uma população pura de células estaminais intestinais é cultivada em uma camada alimentadora 3T3, as células não podem segregar fatores de nicho. Por conseguinte, é necessário completar os factores extrínsecos que se assemelham a factores de nicho. Além do protocolo de manutenção de células estaminais, foi estabelecido um protocolo de diferenciação num modelo de cultura ALI para dar origem a pelo menos quatro tipos de células intestinais principais, ou seja, células Paneth, células entero-endócrinas, células goblet e enterócitos (células absorventes intestinais) . A formação de estruturas intestinais semelhantes a villus foi observada de acordo com os tipos de tecidos originais, tais como os tecidos do intestino delgado e do cólon (Fig. 1). Em uma abordagem diferente da cultura ALI, Kuo e colegas cultos robustly pequenos pedaços de intestino neonatal mouse com um elemento estromal a longo prazo .
a mesma estratégia foi também aplicada a clones de células estaminais gástricas humanas obtidas a partir de biópsia endoscópica. Especificamente, as células gástricas clonogénicas foram estavelmente expandidas numa camada alimentadora 3T3 em combinação com factores de crescimento e pequenas moléculas e diferenciadas em linhagens epiteliais gástricas tipicamente encontradas no estômago, tais como células principais que expressam pepsinogénio . Além das células estaminais clonadas do órgão digestivo, as células progenitoras oviduct do tubo uterino distal também foram capazes de se propagar infinitamente em uma camada alimentadora 3T3 na presença de fatores de nicho . O oviduto distal, fimbria epitélio, é uma simples camada de epitélio colunar que consiste nos seguintes dois tipos de células:: células ciliadas, que aumentam o transporte de gâmetas, e células secretoras, que secretam muco. Usando uma ligeira modificação do protocolo de diferenciação para as células estaminais intestinais, as células estaminais oviductais cultivadas a longo prazo deram origem a uma arquitetura 3D, contendo células ciliadas e secretoras, que foi reminiscente da estrutura in vivo de epitélio . A capacidade de produzir linhagens epiteliais com tipos de células adequadas a partir de uma população de células estaminais pode ser uma ferramenta útil para estudar o desenvolvimento epitelial fisiológico e homeostase e desenvolver modelos de doenças agudas e crônicas in vitro.
células de Câncer de cultura
Desde o primeiro celular do câncer de linha, a linha celular HeLa, foi estabelecida a partir de um cervical de pacientes com câncer, em 1951 , linhas de células de câncer estabelecido a partir de uma ampla variedade de tipos de câncer têm sido amplamente utilizados para estudar o pathobiology de câncer e proporcionou oportunidades para gerar in vivo xenograft modelos e teste de drogas anti-câncer in vitro e in vivo. Embora tenham sido feitos grandes avanços na biologia do câncer usando linhas celulares do câncer, os resultados obtidos usando essas células podem não refletir suficientemente a complexidade da doença, como originalmente esperado, porque o câncer exibe heterogeneidade interpatiente e intratumor, como revelado por recentes avanços na sequenciação da próxima geração . Mais precisamente refletir câncer de fenótipos, incluindo o paciente mutação no gene estado e patologia, Welm e colegas desenvolveram paciente derivada xenograft (PDX) modelos de câncer de mama em nonobese diabética severa imunodeficiência combinada (NOD-SCID) ratos que mantidas as características essenciais do original tumores e exibiu metastático capacidade para sites específicos . Além do modelo de câncer de mama, o estabelecimento de vários tipos de tumores sólidos demonstrou a viabilidade de modelos PDX , que são esperados para acelerar os testes pré-clínicos de novas terapias de câncer e ajudar a realizar o objetivo de “medicina personalizada”.
os métodos de cultura para as células estaminais adultas, tais como os sistemas organoide e alimentador, também são aplicáveis a diferentes abordagens que utilizam células cancerígenas derivadas de doentes. Especificamente, Clevers e colegas relataram que a cultura organoide pode ser usada para modelar o câncer de pâncreas , próstata e colorectal e mostraram que os traços originais do câncer , incluindo heterogeneidade genética e sensibilidade a drogas, podem ser recapitulados. Portanto, eles denominaram este sistema um “Biobank organóide vivo”. Estas tecnologias também podem ser usadas para isolar uma população de células estaminais de uma lesão pré-cancerosa, como o esófago de Barrett, um precursor do adenocarcinoma esofágico humano . As células estaminais isoladas e expandidas do esófago de Barrett foram transformadas através da introdução de antigénio T, hTERT E C-myc e xenograftados em NSG imunocomprometidos (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). Como esperado, as células estaminais do esófago de Barrett transformaram-se em tumores do tipo adenocarcinoma esofágico em ratos. Uma abordagem semelhante demonstrou que as células estaminais oviductais humanas eram a célula de origem no cancro epitelial do ovário seroso de alto grau . Este achado corrobora a patologia humana recente e o modelo transgênico do mouse, que indicou que o epitélio oviductal distal é o tecido de origem deste câncer . Em combinação com o sistema CRISPR/Cas9, as células estaminais normais do cólon foram transformadas sequencialmente através da introdução das mutações condutoras que são frequentemente detectadas no cancro colorectal . As células resultantes foram autorizadas a formar xenografts na cápsula renal e exibiram transformação progressiva em fenotipos tipo adenocarcinoma caracterizados por propriedades invasivas e metastáticas. No geral, a capacidade de isolar e cultura de células a partir de tecidos epiteliais normais com tumor e com o paciente facilita a produção de uma plataforma que não só complementa o trabalho animal clássico in vivo no campo da biologia do câncer, mas também facilita abordagens genômicas e genéticas específicas do paciente in vitro.
modelar a doença inflamatória com células estaminais adultas
modelar a doença humana é dificultada pela acessibilidade limitada dos tecidos doentes humanos. No entanto, os avanços no cultivo de células estaminais adultas permitiram-nos Reproduzir fenótipos de doenças in vitro através da expansão de células estaminais e da obtenção de tipos de células maduras a partir de pequenas amostras de biopsia humana. Uma vez que os métodos de cultura 3D, como A ALI e a cultura organoide, fornecem estruturas que consistem em múltiplos tipos de células e se assemelham à arquitetura de epitélio observada in vivo, eles devem ser adequados para o estudo de doenças inflamatórias, incluindo doenças infecciosas e hereditárias. Especificamente, reproduzir o fenótipo da doença é simples quando o patógeno (ou causa principal) e o tipo de célula alvo são conhecidos.
colite pseudomembranosa (CMP) é causada por um aumento desproporcional da população de Clostridium difficile (C. difficile) após o tratamento com antibióticos. C. difficile é uma bactéria Gram-positiva, formadora de esporos, e produz as toxinas de alto peso molecular TcdA e Tcbdb, que induzem secreção de fluido, inflamação, e dano do tecido cólon. As células epiteliais do cólon diferenciadas das células estaminais clonogénicas do cólon na cultura ALI foram desafiadas com estas toxinas, o que causou danos epiteliais devastadores de uma forma dependente do tempo e da dose. Este resultado indicou que o modelo de cultura 3D pode ser usado para representar C. patologia difficile . Do mesmo modo, o efeito da infecção por Helicobacter pylori (H. pylori), que causa gastrite crónica, úlceras gástricas e cancro, foi estudado micro-injectando H. pylori em culturas organóides. Culturas organóides infectadas por bactérias exibiram inflamação aumentada, tais como ativação NF-kB e indução IL8, e a expressão IL8 foi significativamente mais elevada em culturas organóides do tipo glândula do que em culturas organóides do tipo pit .As células estaminais adultas também foram usadas para modelar doenças hereditárias. Beekman e colegas relataram uma cultura organóide intestinal derivada de doentes com fibrose quística (CF). CF é causado por mutações na fibrose cística do regulador da condutância transmembranar (CFTR), que é normalmente expresso nas células epiteliais de muitos órgãos, como os tecidos pulmonar e digestivo. Embora as culturas organóides intestinais normais exibissem um inchaço robusto em resposta ao Forskolin, a resposta ao inchaço não foi observada em culturas organóides CF . Além disso, quando o CFTR locus mutado foi corrigido utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9 em organóides intestinais de doentes com CF, os genes corrigidos mostraram funcionar funcionalmente . Por conseguinte, a diferenciação in vitro das células estaminais adultas, que se assemelha a fenótipos in vivo com múltiplos tipos de células em combinação com tecnologias de edição de genes, proporciona meios poderosos para tratar doenças humanas e pode proporcionar uma visão directa da patologia humana.
a Aplicação das epitelial de células estaminais para medicina regenerativa
Apesar de as estratégias que utilizam-tronco embrionárias humanas (ES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células para aplicações em medicina regenerativa, poucos ensaios clínicos dessas estratégias estão em curso, que é, em parte, devido às dificuldades de linhagem especificação e a possibilidade de tumorigênese. Uma vez que as células estaminais adultas são essencialmente comprometidas com tipos específicos de tecidos, a produção de tipos de células pretendidos é relativamente fácil, e o risco potencial para a tumorigénese é baixo. Assim, as abordagens terapêuticas visam a utilização de células estaminais adultas como fonte celular para transplantação. Embora Green e colegas estabeleceram o método de cultura de queratinócitos humanos em 1975 e as células cultivadas foram transplantáveis em pacientes com queimaduras ou lesões químicas, o cultivo de longo prazo de outros tipos de células estaminais adultas foi sujeito a barreiras técnicas significativas. Como descrito acima, avanços técnicos recentes superaram esta limitação para diversos tipos de células epiteliais. Assim, a capacidade de expandir rápida e eficientemente as populações de células estaminais é valiosa para o seu uso em medicina regenerativa.
por exemplo, as células estaminais lgr5+ do rato foram expandidas na cultura organóide e transplantadas para o cólon danificado do rato, e as células gravadas que foram capazes de se auto-renovar e diferenciar foram detectadas mesmo após 25 semanas . Numa abordagem diferente, Zhang K e colegas utilizaram células estaminais adultas para um estudo de transplantação. Primeiro, Eles cultivaram com sucesso células epiteliais da córnea em um prato sem células alimentadoras e então descobriram que Pax6 é um fator chave de transcrição que diferencia as células estaminais da córnea (CSCs) dos queratinócitos da pele. Surpreendentemente, a sobreexpressão Pax6 nos queratinócitos induziu células semelhantes às células estaminais do límbal, e estas células podem ser transplantadas para as córneas feridas de coelhos . Dado que os queratinócitos são mais facilmente acessíveis do que os CSCs, este método pode ser aplicável ao tratamento da doença ocular humana. Mais recentemente, Liu et al. comunicou uma abordagem atraente para a reparação e regeneração de tecidos que utilizava células estaminais endógenas. Em seu estudo, as células estaminais epiteliais de lente (LCS) que expressaram Pax6 e Bmi1 foram caracterizadas e exibiram potencial regenerativo in vivo. Foi utilizado um método cirúrgico de remoção de cataratas que preserva Lécs endógenos, e estes Lécs contribuíram para a regeneração espontânea de lentes com função visual em coelhos, macacos e lactentes humanos. Este método pode ser um avanço terapêutico para o tratamento com cataratas e substituir potencialmente a implantação artificial de lentes intra-oculares .Devido às elevadas taxas de turnover de muitas células epiteliais, populações de células estaminais transplantadas são essenciais para a manutenção dos tecidos a longo prazo. Teoricamente, uma única célula-tronco pode reconstituir tecidos inteiros, e vários grupos de pesquisa empiricamente demonstraram esta noção . Apesar do potencial das células estaminais pluripotentes (PSCs), que podem dar origem a todos os tipos de células, é provável que as células estaminais dos tecidos derivadas do PSC não possam ser mantidas in vitro no estado imaturo. Portanto, a utilização de células estaminais adultas para medicina regenerativa apresenta uma vantagem significativa.