Relação entre o período de tempo após a vasectomia e a capacidade reprodutiva dos espermatozóides obtidos por epididymal aspiração

Resumo

plano de FUNDO: não é bem definido se o tempo decorrido após a vasectomia tem qualquer influência sobre o resultado da FIV–ICSI usando epididymal esperma. Analisamos retrospectivamente os resultados de 151 ciclos ICSI em que o esperma de homens vasectomizados foi usado em diferentes períodos de tempo após a vasectomia. Métodos: os oócitos foram obtidos após um protocolo de estimulação ovárica dessensibilizante utilizando o agonista GnRH em associação com a FSH recombinante e HCG. O esperma foi recuperado por aspiração percutânea de esperma epidídimo. Os ciclos foram divididos em três grupos: ≤10 anos após a vasectomia (grupo 1, n = 47), 11-19 anos após a vasectomia (grupo 2, n = 79), e ≥20 anos após a vasectomia (grupo 3, n = 25). RESULTADO: Como pode ser esperado, a média de idade dos homens diferem em três grupos (grupo 3 > grupo 2 > grupo 1), e a média de idade das mulheres também foi significativamente maior no grupo 3 do que nos grupos 1 e 2, embora sem diferenças foram descritas entre os grupos 2 e 3. Todos os outros parâmetros laboratoriais e clínicos foram semelhantes nos três grupos. As taxas de Gravidez e implantação em curso (34, 25, 8% e 22, 15, 6%, respectivamente) diminuíram significativamente do grupo 1 para o grupo 3. CONCLUSAO: As taxas de Gravidez e implantação após ICSI com esperma de homens vasectomizados estão negativamente correlacionadas com o intervalo de tempo da vasectomia, o que não pode ser explicado puramente pelo envelhecimento masculino ou feminino.

Introdução O ICSI é uma técnica de tratamento de reprodução assistida de sucesso que foi desenvolvida originalmente para aliviar a infertilidade masculina (Palermo et al., 1992; Van Steirteghem et al., 1993). Os resultados obtidos com o esperma ejaculado parecem não estar relacionados com a concentração ou morfologia do esperma (Nagy et al., 1995a; Svalander et al., 1996). O prognóstico é comprometido apenas nos casos em que não são encontrados espermatozóides móveis (Nagy et al., 1995a).Em casos de azoospermia obstrutiva e não obstrutiva, utiliza-se rotineiramente a aspiração de espermatozóides Epididimais e testiculares para obter espermatozóides. As taxas de fecundação são semelhantes nestes casos às obtidas com o esperma do ejaculate (Nagy et al., 1995b; Van Steirteghem et al., 1998). ICSI, portanto, tornou-se uma alternativa eficaz para restaurar a fertilidade em casos pós-vasectomia em que a reanastomose falhou ou o período de tempo da vasectomia resultou em locais secundários de obstrução epididimal. Além disso, o ICSI pode eliminar os efeitos negativos na fertilidade dos anticorpos anti-espermatozóides frequentemente presentes nestes homens (Heidenreich et al., 1994). Na maioria dos casos obstrutivos, incluindo homens pós-vasectomizados, a aspiração epididimal do esperma é o método de escolha para obter esperma (Craft et al., 1995). A aspiração de agulha fina, como técnica, é um procedimento mais simples e menos invasivo do que a intervenção microcirúrgica nos epidídimos ou nos testículos (Tournaye et al., 1998).Relatórios recentes sugerem que a fertilidade masculina diminui com a idade (Auroux, 1993). No entanto, já foi publicado anteriormente que, em homens saudáveis normais, a qualidade do sémen por si só não diminui significativamente com o tempo (Fisch et al., 1996). Além disso, o resultado ICSI parece não estar relacionado com a idade paterna (Spandorfer et al., 1998).Por outro lado, os efeitos negativos relacionados com o tempo na qualidade e fertilidade do sémen foram descritos em homens pós-vasectomizados (Urry et al., 1990). Foi notificada uma maior incidência de anticorpos anti-espermatozóides e de aglomeração de espermatozóides juntamente com uma diminuição na proporção de espermatozóides móveis (Weiske, 2001).Devido aos benefícios da ICSI acima sobre a reanastomose, uma proporção significativa de doentes azoospérmicos obstrutivos que procuram tratamento por ICSI são homens vasectomizados. Como ainda não se sabe se o período pós–vasectomia tem alguma influência no resultado da ICSI-IVF, analisamos a relação entre o período de tempo pós-vasectomia e a capacidade reprodutora do esperma após a ICSI.

materiais e métodos

analisámos retrospectivamente os resultados de 151 ciclos ICSI, realizados devido a azoospermia obstrutiva pós-vasectomia, concluída durante o período de junho de 1998 a junho de 2000. Os pacientes foram alocados a três grupos de acordo com o período de tempo pós-vasectomia. O intervalo da vasectomia foi arredondado para o ano completo mais próximo da data da vasectomia para o tempo da ICSI. Todos os casos foram encaminhados para o nosso Centro porque eles escolheram ICSI sobre reanastomose do SAV como a forma primária de terapia. Todos os casos foram submetidos a aspiração percutânea de esperma epidídimo (peso) como a técnica para obter esperma. O grupo 1 consistiu em 47 ciclos em que o período de tempo da vasectomia foi ≤10 anos.; o grupo 2 envolveu 79 ciclos em que o período de tempo da vasectomia foi entre 11 e 19 anos e o grupo 3 incluiu 25 ciclos em que o período de tempo da vasectomia foi ≥20 anos.A estimulação ovárica foi realizada utilizando uma combinação de um agonista GnRH (acetato de leuprolide, Lupron®; Abbott Laboratórios do Brasil Ltda, São Paulo, Brasil), protocolo longo e FSH recombinante (Gonal-F®; Serono Laboratorios, São Paulo, Brasil). O desenvolvimento folicular foi monitorizado com ecografia periódica do estradiol sérico e vaginal. HCG 10 000 UI (Profasi®; Serono Laboratorios) foi administrado quando pelo menos dois folículos atingiram um diâmetro médio de 18 mm e a recolha dos oócitos foi efectuada por aspiração transvaginal guiada por ecografia 34 h depois.

aspiração do esperma epidídimo

o esperma foi recuperado pelo peso. Uma agulha de calibre 27.5 foi introduzida na parte proximal do epidídimo (geralmente localizada no pólo superior do testículo) e uma sucção delicada foi realizada com uma seringa de 1 ml (B-D; Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda, Curitiba, Brasil). O aspirado foi colocado em uma placa de Petri e foi lavado com meio FIV-50 (FIV Science Scandinavian, Gotemburgo, Suécia). A amostra foi avaliada para a presença de esperma móvel. Se na amostra não houve espermatozóides móveis presentes, a aspiração epididimal foi repetida.

procedimentos laboratoriais de embriologia

oócitos colhidos em fluido folicular puro foram imediatamente enviados para o laboratório de embriologia adjacente, onde foram identificados usando um microscópio de dissecação com Ampliação ×50. Após serem identificados, os oócitos foram colocados em um único prato de cultura de poço (3260).; Costar, Cambridge, MA, EUA) com 1, 0 ml de 80 UI / ml de hialuronidase (Hyase-1; IVF Science Scandinavian) durante 30 s e subsequentemente foram lavadas várias vezes em meio FIV-50. Cada oócito foi colocado separadamente dentro de uma gota de 30 µl de meio FIV-50 e coberto com óleo mineral leve (Ovoil 150; IVF Science Scandinavian) e incubado por 2-4 h a 37°C numa atmosfera com 5% de CO2. No final do período de incubação, as células de cumulus e corona radiata foram removidas com uma pipeta de plástico de 135 µm de diâmetro, ligada a uma stripper celular (Mid Atlantic Diagnostics Inc., Medford, NJ, USA).

maturidade Nuclear e qualidade ooplasmática foram avaliadas usando um microscópio de luz invertida (Nikon Diaphot Microscope®; Nikon Corporation, Tóquio, Japão) em ×200 ou × 400 ampliação. Os oócitos da metafase-II (MII) foram microinjectados num período de 2-4 horas após a colheita. Observou-se oócitos da metafase I (em) para a extrusão do primeiro corpo polar a intervalos de 4 h até 8 h após a recuperação, tendo a injecção sido realizada em conformidade. Os métodos de injecção de esperma foram previamente notificados (Abdelmassih et al., 1996).

após a injecção de esperma, os oócitos foram incubados em 1 ml de meio FIV-50, cobertos com óleo mineral, durante 16-18 h. foram observados oócitos 16-18 h após a ICSI, devido à presença ou ausência de pronúcleos e corpos polares (Nagy et al. , 1998a). A fertilização foi considerada normal quando dois pronúcleos claramente distintos estavam presentes. Se foi observado um único pronúcleo, foi realizada uma segunda avaliação aproximadamente 4 horas depois. Quando a presença de três pronúcleos foi detectada, o oócito foi descartado.

os oócitos contendo dois pronúcleos foram cultivados separadamente em gotículas de 30 µl de meio FIV-50 cobertas com óleo mineral numa placa de Petri (3260; Costar) e foram mantidos até transferência. Os embriões foram observados às 42 h (dia 2) e às 68 h (dia 3) após a injecção e classificados de acordo com os critérios propostos pelo Staessen (Staessen et al., 1989). De acordo com o número de blastómeros e com a proporção relativa de fragmentos de anucleatos presentes na zona pelúcida, os embriões foram classificados numa das quatro categorias.: 1, excelente (tipo A), quando não anucleate fragmento foi presente (6 – 8-estágio celular no dia 3); 2, bom (tipo B), quando a <20% de embrião foi fragmentado (6 – 8-estágio celular no dia 3 ou <6 células sem fragmentação); 3, justo (tipo C), quando a quantidade relativa dos fragmentos foi entre 20 e 50%; e 4), ruim (tipo D), quando >50% dos embriões foi fragmentado. Os embriões com >50% de fragmentação não foram transferidos.

no momento da transferência, os embriões eram carregados em 15 µl de meio FIV-50 utilizando um cateter Edwards Wallace de 23 cm (Simcare Manufacturing Ltd, Hythe, Kent, Reino Unido).

A fase lútea foi apoiada pela administração diária de 800 mg de vaginal de progesterona (Utrogestan®; Laboratoires Besins-Isvovesco, Paris, França) e transdermic 100 µg de estradiol patches alterada diariamente (Estraderm TTS100®; Biogalênica Laboratório, São Paulo, Brasil). Os níveis séricos de β-HCG foram medidos 12 dias após a transferência do embrião.Foi efectuada uma ecografia Transvaginal

em todos os doentes com títulos crescentes de β-HCG; foram avaliadas a presença e o número de sacs gestacionais intra-uterinos, bem como a presença de um pólo fetal e actividade cardíaca. A gravidez foi monitorada pelo obstetra do paciente e o resultado final foi relatado à clínica tanto pelo obstetra quanto pelo paciente.

análise estatística

a análise de Sentido Único da variância (ANOVA) e testes de Kruskal–Wallis foram usados para comparar meios de idade feminina e masculina, taxa de fecundação, qualidade embrionária, número de embriões transferidos e período de tempo após a vasectomia. A análise da tabela de contingência e os testes exatos de Fisher foram usados para comparar as taxas de gravidez, implantação e aborto.Os resultados mais importantes dos 151 ciclos incluídos no estudo são apresentados na tabela I. A Idade Média dos homens aumentou do grupo 1 para o grupo 3, e a diferença entre cada grupo foi estatisticamente significativa (P < 0, 0001). A Idade Média das mulheres foi significativamente inferior no grupo 1 em comparação com os grupos 2 e 3, mas não diferente no grupo 2 em comparação com o grupo 3 (Tabela I).

o número médio de oócitos recuperados e injetados, e as taxas de fertilização, foram semelhantes em todos os três grupos. A qualidade dos embriões e o número de embriões transferidos foram também semelhantes nos três grupos (Quadro I).

a taxa de gravidez clínica e a taxa de gravidez em curso correlacionaram-se significativamente com o período de vasectomia (p < 0, 05; teste de tendência χ2), e o período mais longo de vasectomia foi associado com menos gravidezes (Tabela I). A taxa de implantação também diminuiu do grupo 1 para o grupo 3, e a diferença entre todos os grupos foi estatisticamente significativa (P < 0,05, análises de tabela de contingência e teste exato de Fisher). A taxa de aborto mostrou uma tendência a aumentar do grupo 1 para o grupo 3, mas não atingiu significância estatística entre os grupos.

a fim de excluir o efeito da idade feminina nos resultados, analisámos os dados de 84 dos 151 ciclos em que apenas foram incluídas as mulheres com idade ≤35 anos. Os resultados, organizados da mesma maneira em três grupos, são apresentados na Tabela II. A diferença na média de idade dos três grupos permaneceu significativa (P < 0.0001), mas feminino idade não diferiu significativamente entre os três grupos. O número de oócitos injetados e fertilizados também foi semelhante nos três grupos, bem como o número e qualidade de embriões transferidos para os pacientes. As taxas de Gravidez e implantação em curso foram significativamente mais elevadas nos grupos 1 e 2 quando comparadas com o grupo 3 (Tabela II).

discussão

os nossos dados confirmam que a aspiração percutânea de esperma epidídimo combinada com ICSI é uma opção de tratamento bem sucedida para o alívio da infertilidade pós-vasectomia. A técnica de recuperação do esperma é simples, realizada com anestesia local e pode ser repetida sem danos óbvios ao epidídimo.

é importante notar que os resultados do nosso estudo sugerem, pela primeira vez, uma correlação negativa entre o resultado da gravidez da fecundação assistida e o período de tempo entre a vasectomia e o tratamento. A diferença nas taxas de Gravidez e implantação persistiu após os resultados serem corrigidos para a idade das mulheres. As únicas diferenças clínicas evidentes remanescentes foram a Idade Média dos machos entre os grupos e o período de vasectomia. A influência da idade masculina nos resultados da reprodução assistida não está bem determinada. Alguns estudos sugerem um declínio no potencial de fertilidade com o avanço da idade masculina (Auroux, 1993), no entanto, a maioria dos estudos não estabeleceu uma correlação entre o envelhecimento e o potencial reprodutivo dos homens (Krause e Habermann, 2000). Além disso, o acompanhamento individual até 25 anos não revelou quaisquer alterações importantes (Fisch et al., 1996). Mais importante no que diz respeito ao nosso estudo, os resultados ICSI para diferentes categorias de diagnóstico não são afetados pela Idade do parceiro masculino (Spandorfer et al.( 1998) em contraste com o papel importante da Idade da Parceira (Abdelmassih et al., 1996; Devroey et al., 1996).

a taxa de sucesso da reversão da vasectomia na restauração da fertilidade é uma relação inversa com o período de tempo da vasectomia (Belker et al., 1991). Até agora, os efeitos negativos relacionados com o tempo da vasectomia em relação à fertilidade foram atribuídos a fatores mecânicos (a incidência crescente de locais secundários de obstrução epididimal) que tornaram a restauração anatômica mais difícil, e ao aparecimento de títulos significativos de anticorpos anti-espermatozóides (Heidenreich et al., 1996). A ICSI supera obviamente o bloqueio mecânico e os resultados obtidos com a técnica são independentes de fatores imunológicos (Nagy et al., 1995c).

todos os casos incluídos em nosso estudo foram submetidos a aspiração epididimal do esperma. Silber et al. têm sugerido que em casos de epidídimo cronicamente obstruído, o esperma sofre alterações relacionadas com a senescência com uma diminuição significativa na motilidade para a porção distal (Silber et al., 1995). Por outro lado, Moore relatou que nestes casos um número desproporcional de espermatozóides mortos ou moribundos também é encontrado na porção proximal (Moore, 1998). O autor sugere que, em condições normais, o fluido epididimal protege espermatozóides viáveis de enzimas acrosomais libertadas por espermatozóides no processo de degeneração. A estagnação secundária à obstrução crónica interferiria com este mecanismo de protecção. Além disso, foi demonstrado que, em homens com azoospermia obstrutiva, o ADN do esperma testicular está significativamente menos danificado do que o ADN do esperma epididimal proximal (Steele et al., 1999). No mesmo estudo, os autores descobriram que a qualidade do DNA no esperma obtido do testículo é a mesma que a encontrada nos homens normais, sugerindo que a lesão encontrada no esperma epididimal é adquirida com o tempo após a produção. É tentador especular que a lesão epididimal do DNA do esperma aumenta com o tempo de obstrução e, nos casos apresentados aqui, o tempo de vasectomia. Na mesma linha de pensamento, o uso de esperma imotil (devido à necrozoospermia) ejaculado ou epididimal para ICSI foi associado com fertilização muito pobre e desenvolvimento embrionário; no entanto, o esperma testicular (do mesmo doente), mesmo que imotilo, proporcionou um resultado muito melhor do ciclo de tratamento (Nagy et al., 1995a; Tournaye et al., 1996; Nagy et al., 1998b).Neste estudo, não foram observadas diferenças significativas na taxa de fecundação e na qualidade dos embriões transferidos a 72 horas após a fecundação entre os três grupos. Os efeitos do uso de espermatozóides danificados na fertilização podem ser mascarados com o uso de ICSI, e os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário dependem principalmente da informação materna como o genoma embrionário é ativado após o estágio de 8 células (Braude et al., 1988). No entanto, o aumento da lesão do ADN do esperma epidídimo (utilizado exclusivamente nos casos notificados) pode constituir uma explicação para as taxas de implantação embrionária mais baixas e para as taxas de aborto mais elevadas encontradas nos casos com um período mais longo de vasectomia.

os nossos resultados diferem dos dados comunicados por outros (Sukcharoen et al., 2000) mas pode não estar em contradição directa. O número de casos incluídos em nosso estudo foi significativamente maior e os dados previamente relatados incluíram alguns casos em que ICSI foi realizado com esperma obtido a partir dos testículos.

os achados aqui relatados podem ter implicações clínicas importantes. A aspiração percutânea de esperma epididimal é um procedimento simples, rápido e popular para obter esperma de homens com azoospermia obstrutiva.; no entanto, à luz do presente estudo, a aspiração de agulha fina a partir dos testículos pode representar uma melhor abordagem, especialmente nos casos com tempo prolongado de obstrução. No entanto, deve proceder-se a uma maior recolha e análise dos dados obtidos a partir de estudos prospectivos, a fim de estabelecer a melhor intervenção nestes casos.