Um domínio conceitual e prático síntese de cDNA microarray tecnologia: implicações clínicas e básicas ciências

Braz J Med Biol Res, de outubro de 2005, Volume 38(10) 1543-1552 (Revisão)

conceitual e prático síntese de cDNA microarray tecnologia: implicações clínicas e básicas ciências

V. de Mello-Coelho e K. L. Hess

Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

Resumo
Texto

Correspondência e notas de Rodapé

Resumo

cDNA microarray é uma tecnologia inovadora que facilita a análise da expressão de milhares de genes simultaneamente. A utilização desta metodologia, que está em rápida evolução, requer uma combinação de conhecimentos especializados das ciências biológicas, matemáticas e estatísticas. Nesta revisão, vamos tentar fornecer uma visão geral dos princípios de cDNA microarray tecnologia, os interesses práticos do processamento analítico dos dados obtidos, a correlação desta metodologia com outros dados, métodos de análise, tais como a imunohistoquímica no tecido microarrays, e o cDNA microarray aplicação em áreas distintas do básico e ciências clínicas.

palavras-chave: Biotechnology, cDNA microarray, Gene expression, Genomics

Introdução Os Genes

são unidades hereditárias formadas por sequências de ácido desoxirribonucleico (ADN) organizadas nos cromossomas do núcleo celular. O complexo processo de transcrição destas sequências resulta na geração de ácidos ribonucleicos messenger (mRNA). Estes códigos mRNA para proteínas, que são compostos de aminoácidos, e executar a função designada do gene (1). Assim, as características estruturais e funcionais das células e tecidos são determinadas pela expressão simultânea, seletiva e diferencial de milhares de genes.

desde a última década, estudos envolvendo mapeamento de genes, clonagem e sequenciação forneceram informações significativas para a análise estrutural de genomas distintos (2,3). A quantidade de informações obtidas a partir destas investigações exige a organização dos dados adquiridos. Para satisfazer esta necessidade, foram criadas bases de dados públicas para armazenar milhões de sequências de genes e marcas de sequências expressas (ESTs), permitindo a adesão a sequências de genes para análise das semelhanças, bem como as diferenças entre genomas de espécies distintas (4).Estudos estruturais dos genomas têm levantado numerosas questões relacionadas com a compreensão funcional e regulamentar dos perfis de expressão genética em diferentes tipos celulares e tecidos de vários organismos (3,5,6). A tecnologia de microarray de DNA foi desenvolvida para estudar o processamento biológico complexo envolvendo vários milhares de genes (7,8). Uma dessas tecnologias de microarray utiliza cadeias ou sondas de ADN únicas (oligómeros) que são impressas numa superfície de vidro utilizando a fotolitografia (9). Outra metodologia de microarray de DNA, que é o foco da presente revisão, é a tecnologia de microarray de DNA complementar (cDNA) (10). Com estas metodologias é possível 1), simultaneamente, a comparar a dinâmica do padrão de expressão de milhares de genes em células ou tecidos, 2) para detectar diferenças moleculares durante as distintas fases dos processos celulares, por exemplo, diferenciação, proliferação e indução de apoptose, 3) identificar transcricional diferenças entre os não doentes e condições patológicas, 4) identificar alterações nas células devido a uma droga de resposta, e 5) para identificar romance de biomarcadores para o potencial de utilização no diagnóstico, prognóstico e terapêutica clínica de doenças.

the principles of cDNA microarray technology

A classical methodology used for the detection and quantification of mRNA in a given cell is called Northern blot analysis (11). O princípio principal da análise de manchas do Norte é a hibridação de uma sonda específica de genes radiolabelados ao ARNm ligado a um filtro, a fim de determinar se esse gene está presente. Outro método usado para detectar a expressão de um gene específico é a transcrição reversa da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). RT-PCR envolve o uso de primers específicos do gene e transcriptase reversa para sintetizar uma sequência de cDNA para o mRNA. O cDNA é então amplificado por múltiplas rondas de transcrição mediada pela polimerase deste modelo cDNA (12). Existem vários tipos de RT-PCR e o mais preciso em termos de quantificação é o método RT-PCR em tempo real, que requer um sistema automatizado capaz de detectar fluorescência induzida durante a reação RT-PCR (12). Durante a RT-PCR, a expressão de um determinado gene pode ser deduzida comparando-o com genes constitutivamente expressos, também conhecidos como “housekeeping” genes.

a tecnologia de microarray cDNA, que analisa os níveis de expressão genética de milhares de genes simultaneamente, é baseada nos mesmos princípios que os para análises de blot do Norte e RT-PCR (7,8). Essencialmente, o microarray cDNA é a hibridação de milhares de genes do cDNA para seus alvos correspondentes em um chip ou filtro. No entanto, o desafio atual desta tecnologia é analisar as quantidades substanciais de dados numéricos brutos obtidos através da aquisição de sinais de hibridação (13). Análises computacionais e bioestatísticas são necessárias para processar com precisão dados significativos para os objetivos específicos da investigação (Figura 1).

produzindo uma matriz de microarray cDNA

recentemente, várias empresas projetaram microarrays cDNA focados em sistemas específicos de perfis de expressão genética. Estas matrizes estão disponíveis comercialmente por empresas de biotecnologia, incluindo a SuperArray Bioscience Corporation e a Affymetrix, para uso a preços acessíveis. Nesta seção, tentamos descrever os passos básicos na produção de uma matriz de microarray cDNA.

o primeiro passo para a produção de uma matriz de microarray cDNA é a selecção e amplificação de fragmentos totais ou parciais de sequências cDNA a imprimir em substratos, que serão posteriormente hibridizados com sequências cDNA-alvo (14,15). Os métodos mais comuns para seleccionar sequências baseiam-se nos seguintes recursos:: 1) bancos de dados genéticos como o Unigene, o dbEST e o GenBank, que dão informações sobre a função específica do gene e a localização dos cromossomas; 2) coleções de clones ou sequências cDNA disponíveis em páginas web de Empresas Comerciais; 3) construções personalizadas de bibliotecas cDNA de células-alvo ou tecidos previamente clonados e sequenciados para identificação de EST. Uma vez selecionados, os fragmentos de cDNA são amplificados por PCR em microplates multiwell, purificados por precipitação química, e então examinados para a qualidade e quantidade por eletroforese em gel. Os produtos PCR são impressos em um slide ou membrana usando uma máquina robótica, o microarrayer. Durante a impressão robótica, ou deposição, do DNA, os tubos capilares recebem uma pressão constante e depositam serialmente o DNA na lâmina ou membrana, criando assim um projeto de “microarray” (16). Vários tipos de substratos, incluindo lâminas de vidro e membranas de nylon, são pré-tratados para aumentar as suas cargas hidrofóbicas, resultando assim num aumento da adesão total das sequências de ADN aos substratos (13). Mais importante ainda, indexação de dados contendo a localização de milhares de clones cDNA impressos nos substratos é realizada por uma rotulagem cautelosa de cada microplate usando software projetado para análise de banco de dados. Este banco de dados também inclui a identidade do clone( ID do clone), o nome do gene, a localização do cromossomo e a(s) função (ões) do gene.

hibridização da sonda cDNA com a matriz de microarray de ADN alvo

um factor crucial para a hibridização bem sucedida da sonda cDNA à matriz de microarray de ADN alvo depende da qualidade do ARNm a partir de células ou tecidos. Os contaminantes da sonda RNA com DNA genômico, proteínas ou resíduos de detergente podem resultar em dados falsos-positivos/falsos-negativos.

etiquetar a sonda durante a síntese de cDNA por transcrição reversa de sequências de ARN depende do tipo de microarray cDNA utilizado (16). Em geral, quando a análise de microarray cDNA é realizada usando membranas de nylon como substrato, a sonda RNA é marcada radioativamente pela incorporação de nucleotídeos dCTP-P33 durante o processo de transcrição reversa (7). No caso de um microarray cDNA impresso em lâminas de vidro, utilizam-se nucleótidos radioativos (17) e corantes fluorescentes com elevadas taxas de incorporação, tais como as cianinas cy-3 dUTP e Cy-5 dUTP (8). Para mais informações sobre os tipos de microarrays cDNA e o processo de hibridação (7,8,17-20), Ver Tabela 1.

ferramentas de Análise para a identificação de padrões de expressão de genes utilizando cDNA microarray tecnologia

Ferramentas para a análise de grandes quantidades de dados gerados a partir de cDNA microarrays ainda estão sendo desenvolvidos. Atualmente, os investigadores analisam dados de microarray cDNA usando diversos programas de software (21-24). Isto significa que não existe um único método para analisar a quantidade massiva de dados obtidos usando esta tecnologia. O uso de ferramentas bioestatísticas tornou-se cada vez mais importante na análise do significado dos perfis de expressão genética.

para fornecer uma ideia geral sobre alguns dos tipos de métodos usados para analisar dados de microarray cDNA, vamos descrever e discutir passos que poderiam dificultar o processo de análise. Da maior importância é a validação dos resultados através da realização de múltiplas experiências replicadas. Após a aquisição dos sinais de hibridação, os substratos são examinados visualmente usando programas computacionais. Neste caso, considera-se a qualidade dos substratos. Por exemplo, imagens de manchas difusas, precipitados de corante, ou amostras com sinais de fundo fortes são geralmente descartadas. Esta análise é importante para eliminar artefatos, o que pode resultar na detecção de sinais falsos positivos (16). Vários investigadores aplicam o método da subtração de fundo dos sinais de hibridação aos sinais não específicos em fundo. Nesta etapa, dependendo do software utilizado, é possível subtrair sinais de fundo das duas formas seguintes:: 1) pela média aritmética ou mediana resultante da intensidade do sinal entre os sinais positivos de pontos no substrato, ou 2) pela média aritmética ou mediana do sinal não específico, tais como a intensidade do sinal resultante da área imediata ao redor de cada ponto correspondente a um gene específico de sinal. Por estes dois métodos, a média aritmética ou os valores medianos são subtraídos do sinal positivo que representa um gene expresso diferencialmente (16). A aquisição de intensidade de sinal positivo nas grelhas de localização criadas usando software específico é completada em valores arbitrários conhecidos como algoritmos. Estes valores podem ser acessados diretamente no software de banco de dados, que contém informações previamente catalogadas de cada gene impresso no substrato.

devido à enorme quantidade de genes analisados simultaneamente e à variabilidade em todas as etapas técnicas da técnica de microarray cDNA, é importante criar um fator de ajuste ou compensação, que é feito através de um processo de normalização de dados. A existência de Sinais não específicos nos substratos, problemas relacionados com a quantidade ou qualidade do RNA antes da hibridação, ou variabilidade na incorporação do RNA na sonda podem resultar no comprometimento da normalização da amostra (14,16). Para uma interpretação mais significativa dos dados, o processo de normalização realiza uma análise comparativa da média aritmética dos algoritmos de um grupo individual com outro, frequentemente escolhido como um controle (24,25). Existem vários tipos de métodos de Normalização e selecionar o método mais apropriado pode ser um desafio. A razão para isso é que múltiplas variáveis experimentais muitas vezes impedem a identificação precisa de genes expressos diferencialmente sem resultados falsos-positivos/falsos-negativos contaminando a avaliação dos dados. O suporte matemático, estatístico e bioinformático é fundamental nesta fase na tecnologia de microarray cDNA.

os métodos de normalização incluem: 1) a razão logarítmica dos níveis de expressão medidos entre grupos distintos, com base na média, mediana, diferenças medianas ou variância obtida a partir de todos os sinais positivos localizados nos substratos; 2) análise de regressão, que é avaliada através do coeficiente de correlação ou a distância Euclidiana, e é baseado na distribuição representada pelos algoritmos correspondentes às intensidades de sinal nas diferentes amostras de um mesmo grupo, e 3) testes estatísticos como o teste-t ou associativa análise, que considere múltiplas comparações pareadas com base no significativas limite de P < 0,05 e t-teste de limiar de significância de correção, respectivamente (25,26). Além disso, o método de normalização de regressão linear (de baixo valor), frequentemente utilizado para matrizes fluorescentes, explica variações decrescentes de sinais de hibridação de intensidade e localização espacial do cDNA malhado no slide (27).

após a normalização, o método mais simples para identificar diferenças entre padrões de expressão genética é usar a diferença de razão entre uma amostra e seu controle apropriado. Neste caso, um limite arbitrário é estabelecido e a partir deste valor é possível selecionar os genes expressos diferencialmente usando software de banco de dados. Por exemplo, é possível estabelecer um limiar de 2 vezes para identificar genes com alterações significativas no nível de expressão. Durante este processo, os genes dentro desta gama serão selecionados e organizados em tabelas localizadas na base de dados. Os genes que cumprem os critérios de seleção podem ser visualizados a partir de bases de dados usando software que mostra mapas auto-organizativos (28,29). Além disso, essas mudanças nos perfis de expressão genética entre grupos distintos podem ser visualizadas em dendrogramas baseados em análise de clustering hierárquica (25,29,30). Neste caso, os genes que são mal regulados são geralmente mostrados em genes verdes e acima regulados são geralmente mostrados em vermelho. Como a diferença de regulação do gene é mais intensa, assim é a sua respectiva cor. Programas de Software para analisar dados de microarray cDNA estão disponíveis através da Internet.

é importante notar que a análise dos perfis de expressão genética adquiridos pela tecnologia de microarray cDNA envolve milhares de genes sendo analisados simultaneamente. Antes de realizar estudos fisiológicos de genes seleccionados, os resultados do microarray cDNA devem ser confirmados ao nível de ARN pela análise Northern blot ou RT-PCR em tempo real (14). Isto elimina a possibilidade de resultados de microarray cDNA falsos positivos devido à hibridação cruzada entre genes dentro da mesma família de genes. A confirmação adicional também é altamente recomendada no nível proteico, como por análise Western blot, citometria de fluxo ou imunohistoquímica. Neste contexto, é actualmente possível avaliar os genes ao nível das proteínas utilizando ensaios de microarray tecidular (31-33). O ensaio de microarray tecidular é um método que permite a avaliação de até mil tecidos de uma só vez, utilizando um marcador específico. Basicamente, pequenas biópsias principais de 1 mm ou menos são isoladas a partir de blocos de tecido embebidos em parafina individuais com um dispositivo metálico especial ou agulha, e colocadas em outro bloco de parafina de uma maneira arrayed. As vantagens desta técnica são: 1) a economia e preservação dos tecidos originais obtidos para biopsia para construir a matriz; 2) para evitar problemas técnicos, uma vez que a matriz é construída em uma única lâmina de vidro, facilitando assim os processos técnicos de lavagem e coloração, e 3) a velocidade para realizar a análise in situ simultaneamente em várias amostras de tecido ao mesmo tempo. Clinicamente, é uma técnica poderosa para usar conjuntamente com a análise de microarray cDNA para identificar novos biomarcadores para potencial uso como ferramentas diagnósticas, prognósticas e terapêuticas contra condições patológicas (31,32).

tecnologia de microarray cDNA: applications and perspectives

In terms of application, cDNA microarray technology leads to the identification of specific genes and allows researchers to compare the profiles of gene expression in normal versus patological conditions in various organisms. Em ciência básica, o microarray cDNA tem sido usado para identificar o papel de vários genes envolvidos em processos celulares, como a diferenciação celular, através da comparação de padrões de expressão genética entre culturas celulares normais e transfetadas, por exemplo (34). Muitos grupos de pesquisa têm usado a tecnologia de microarray cDNA para estudar tipos distintos de cancros, bem como a patogênese de doenças infecciosas (35-40). Neste caso, a identificação de novos genes ou alterações nos padrões de expressão dos genes nos tecidos, desde os não doentes até aos doentes, contribuiu para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares que regulam o início e o progresso das doenças. Além disso, a cDNA microarray tem sido considerada uma metodologia muito interessante na indústria farmacêutica. Neste contexto, a análise do perfil de expressão genética em grande escala de células submetidas a testes de fármacos distintos poderia ser relevante para classificar potenciais agentes para uso terapêutico (41). Vários exemplos da aplicação da metodologia de microarray cDNA em ciências básicas e clínicas (34-48) estão descritos na Tabela 2.

a análise de microarray cDNA é uma metodologia cara, mas a abundância de resultados gerados por esta tecnologia é um retorno inquestionável. Uma vez que uma unidade central de pesquisa é organizada para o desenvolvimento desta metodologia, vários pesquisadores podem aproveitar a vantagem de usar substratos previamente impressos de microarray cDNA para investigar genes diferentes expressos em ambas as áreas biológicas e clínicas. Para a organização de unidades de microarray cDNA, deve ser considerada a interação multidisciplinar entre arenas matemáticas e biológicas. A Figura 2 apresenta um modelo esquemático hipotético simples que demonstra a infra-estrutura de uma unidade de microarray cDNA.

finalmente, bancos centralizados contendo dados de perfis de expressão genética analisados pela tecnologia de microarray cDNA foram criados e estão disponíveis para inspeção através da Internet (49,50). Desta forma, diferentes grupos em todo o mundo poderão comparar dados de perfis genéticos selecionados com outros depositados em bancos de dados moleculares, como a expressão genética Omnibus ou Array Express, projetados pelo Instituto Europeu de Bioinformática (51).

um problema que restringiu uma interação benéfica entre vários grupos de pesquisa usando tecnologia de microarray cDNA é a falta de padrões para a apresentação e troca de resultados. Para compensar esta situação, a informação mínima para a anotação de um experimento de Microarray (MIAME) foi criada (52). As diretrizes que levam à padronização de experimentos de microarray cDNA foram propostas pela Micro-array Gene Expression Data Society (MGED). O MIAME é basicamente composto por seis seções: 1) projeto experimental; 2) projeto de array; 3) amostras utilizadas, extratos preparados e hibridação; 4) procedimentos e parâmetros de hibridação; 5) imagem, quantificação e medição de parâmetros, e 6) tipos, valores e especificações para controles de normalização. O MIAME tornou-se um requisito para publicar os resultados do microarray cDNA em muitas revistas científicas. Além disso, grupos distintos, incluindo MGED, Rosetta, Agilent e Affymetrix, trabalharam juntos usando bioinformática para projetar a expressão genética microarray (MAGE), que é uma plataforma de estrutura flexível comum que permite a comunicação entre diferentes grupos de pesquisa usando a tecnologia cDNA microarray. MAGE é composto do seguinte: 1) MAGE-ON (modelo objeto), um modelo de dados centrado que usa linguagem de Modelagem Unificada e implementa os requisitos do MIAME; 2) MAGE com ML (markup language), que documenta a tradução de um MAGO-OM para um baseado em XML, formato de dados, e 3) MAGE-SLK, livremente acessível software que define o application programmers interface para MAGE-OM, permitindo, assim, exportação de dados para MAGE-ML e, posteriormente, resultando no armazenamento de dados em um banco de dados relacional (53).Recentemente, a nanotecnologia tem sido amplamente implementada em várias áreas, como aplicações industriais, farmacêuticas e governamentais, para melhorar os avanços científicos modernos. Devido às características físicas e químicas únicas das nanopartículas, estes materiais têm a capacidade de melhorar dispositivos sensoriais, aditivos de propulsão, técnicas de remodelação de tecidos e mecanismos de alvo de drogas. Além disso, a nanotecnologia tem sido utilizada para melhorar a proficiência em microarray (54) e para ajudar no desenvolvimento de nanoarrays proteicos (55). No contexto laboratorial, os cientistas estão agora a começar a investigar o potencial impacto positivo/negativo que as nanopartículas têm na indução/inibição de genes dentro das células, utilizando a técnica de microarray (56). Finalmente, a combinação da nanotecnologia com a tecnologia de microarray tem avançado até mesmo o conhecimento atual de genes regulados diferentemente durante os processos de doenças (57,58).Em conjunto, estas ferramentas podem contribuir para a compreensão das novas funções genéticas em diversos genomas e de como se correlacionam com a patogênese da doença em seres humanos. O desenvolvimento e aplicação da tecnologia de microarray cDNA trouxe muitos progressos para a descoberta de medicamentos, diagnósticos de pesquisa e potencial terapia genética destinada ao tratamento de várias doenças. Esta tecnologia fundamental auxilia os pesquisadores na compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos em múltiplos e diversos processos biológicos.

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correspondência e notas