rapoarte oncologice

Introducere

cancerul pulmonar este o tumoare malignă cu cea mai maremorbiditate și mortalitate la nivel mondial, iar incidența sa este în creștere. Aproximativ 80% din boală poate fi atribuităcancerul pulmonar fără celule mici (NSCLC) (1). Datorită limitărilor tehnicilor de diagnostic precoce și lipsei unor manifestări clinice specifice timpurii, 70-80% dintre pacienți sunt diagnosticați în stadii avansate(2). Prin urmare, identificarea asafe și tratament eficient de droguri pentru NSCLC este crucială.

descoperirile recente au arătat că incidența,dezvoltarea și transferul NSCLC nu sunt influențate doar de factori genetici, dar că schimbarea epigenetică este,de asemenea, importantă, inclusiv ARN necodificator cu molecule mici (ncRNA) (3). MicroARN( miARN), o clasă de endogenmici ncRNA cu o lungime de ~21-25 baze, existente pe scară largă îneucariote, pot identifica ARNm-ul unei gene țintă specifice(4). Peste 50% din miARN genesunt mapate în site-uri fragile legate de NSCLC sau regiuni genomice,sugerând că expresia miARN poate fi strâns asociată cu NSCLC. După cum sa raportat, expresia unui număr mare de miARN innsclc arată tulburare și dezechilibrul miARN promovează progresul ciclului celular NSCLC, efectul anti-apoptotic, invazia celulară îmbunătățită și metastazele cancerului pulmonar cu celule mici(5).

calea de semnalizare PI3K/Akt joacă un rol important în supraviețuirea celulară mediată de factorul de creștere. Constatările anterioare au arătat că tulburarea căii PI3K/Akt / mTOR poate juca un rol important în formarea NSCLC (6). De asemenea, s-a raportat că semnalul de proliferare celulară generat de combinația unui număr de receptori transmembranari și liganzi poate activa transmisia semnalului PI3K/Akt/mTOR, care este strâns asociat cu proliferarea NSCLC și starea de supraviețuire (7). Acești receptori includ c-met,receptorul factorului de creștere epidermal (EGFR), c-kit și receptorul factorului de creștere asemănător insulinei (IGF-IR).

curcumina este un ingredient activ natural extras din rizomul uscat al plantei din genul curcuma Curcuma, turmeric andCurcuma, cu efecte farmacologice extinse, toxicitate scăzută și toleranță bună și, datorită valorii sale economice, a devenit un punct fierbinte pentru explorare (8). Constatările studiilor axate pe curcumină au identificat o gamă largă de activități farmacologice,cum ar fi antiinflamatoare, anti-oxidare, lipide, antivirus, anti-infecție,anticancer, anticoagulant, fibroză anti-hepatică și ateroscleroză, toxicitate scăzută și puține efecte secundare (9-13).Cu toate acestea, efectul curcuminei asupra NSCLC și mecanismul submolecular rămâne neclar. În studiul de față, am analizat efectul anticanceros al curcuminei asupra proliferării celulare și apoptozei NSCLC umane și am identificat o posibilă relație între acest efect și calea de semnalizare PI3K/Akts modulată de miARN-192-5p.

materiale și metode

produse chimice

Dulbecco ‘s modified Eagle’ s medium (DMEM) și fetalcalf serum (FBS) au fost achiziționate de la Gibco (Carlsbad, CA, SUA) și(America de Sud). Bromura de 3-(4,5-dimetil-tiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliu (MTT) a fost achiziționată de la Sangon Biotech(Shanghai, China). Setul de detectare a apoptozei am fost achiziționat de labd Biosciences (San Jose, CA, SUA). Testul de activitate caspase-3kit a fost achiziționat de la Promega (Madison, WI, SUA).

cultura celulară

celulele epiteliale pulmonare normale NCL-H460 și BEAS-2e și celulele canceroase pulmonare umane a549 au fost obținute de la Centrul CellResource al celei de-a doua Universități Medicale Militare. Aceste celule au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS (ambele din gibco), penicilină 100 U/ml și streptomicină 100%/ml la 37 C și un incubator umidifid cu 5% CO2. Au fost examinate concentrațiile de curcumină (5,10,20 și 40 de Centimetre) și perioadele de timp (12 și 24 de ore) față de celulele a549. Structura chimică a curcuminei este prezentată în Fig.1.

analiza viabilității celulare

celulele au fost însămânțate la o densitate de 5 oct 103/puț în plăci cu 96 de puțuri. Pe scurt, viabilitatea celularăa fost măsurată prin testul MTT (Sangon Biotech). Zece microlitri MTT (5mg/l) au fost adăugați în fiecare godeu și incubați timp de 4 ore la 37 CTC în incubator ahumidificat cu 5% CO2. Sulfoxid de dimetil(150 ilqutl; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA)au fost adăugate la fiecare fântână și agitate timp de 20 de minute la temperatura camerei. Absorbanța a fost măsurată la 450 nM folosind un cititor amicroplate.

analiza apoptozei Anexinei V-FITC/iodură de propidiu (PI)

celulele au fost însămânțate la o densitate de 1,106/godeu în plăci cu 6 godeuri. Celulele cultivate au fost spălate de două ori cu PBS rece ca gheața și apoi colorate cu anexa V-FITC și folosind kitul de detectare a apoptozei i conform instrucțiunilor producătorului (bd Biosciences). Apoptoza a fost analizată prin intermediul flowcytometric folosind software-ul Cellquest Pro (IVD) (ambele de la BDBiosciences).

analiza de activare a caspazei-3

celulele au fost însămânțate la o densitate de 5,103/godeu în plăci cu 96 de godeuri. Activitatea Caspase-3 a fost măsurată folosind un kit de testare a activității caspase-3 conform instrucțiunilor producătorului (Promega). O sută de microliteri tampon de reacție cu substrat de 10 ilft ASP-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroanilină (pNA) a fost adăugat în 10 ilft proteincelular lizat/godeu și incubat la 37 ilft C timp de 6 ore. activitatea caspazei-3a fost analizată la o absorbție de 405 nm.

transfecție celulară

mir-192-5p, anti-miR-192-5P și controlmimics negativ (miR-NC) au fost toate achiziționate de la Sangon Biotech. Celulele au fost însămânțate în plăci cu 6 puțuri și au crescut la 50-60% confluență priorto transfecție. Mimicii au fost transfectați cu Lipofectamină2000 în celule conform instrucțiunilor producătorului (Invitrogen Life Technologies). Gena sau proteina a fost izolată 24 transfecție hafter și utilizată pentru transcriere inversă-cantitativăreacția în lanț a polimerazei (RT-qPCR) sau,respectiv, analiza western blot.

RT-qPCR

celulele au fost însămânțate la o densitate de 5,103/godeu în plăci cu 96 de godeuri. ARN-ul Total a fost extrasdin celule folosind reactiv TRIzol (Invitrogen Life Technologies).Concentrația ARN a fost determinată cu ajutorul unui spectrofotometru nanodrop nd-1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, Statele Unite ale Americii). Cuantificarea miARN-urilor a fost efectuată de un kit de testare miARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA,SUA). ARN-ul Total a fost supus sintezei ADNc de primă catenă șiexaminate folosind un kit de reactiv RT PrimeScript (ambele din Takara,Shiga, Japonia). qPCR a fost realizat folosind SYBR-Green PCR Master Mix (Takara) pe sistemul ABI 7500ht. Primerii utilizați înacțiunile sunt prezentate în tabelul I.

tabelul I primerii PCR utilizați înacțiuni.

analiza Western blot

celulele au fost însămânțate la o densitate de 5 x,103/godeu în plăci cu 96 de godeuri. Celulele cultivate au fost spălate de două ori cu PBS rece ca gheața și incubate cu tampon de liză rece ca gheața timp de 30 de minute pe gheață. Lichidul celular a fost colectat și centrifugat la 12.000 XCT. g timp de 10 min la 4 XCT. Concentrația de proteine solubile a fostdeterminată utilizând un kit de testare a proteinelor BCA (Sigma, St.Louis, MO,SUA). Proteinele totale (10%) au fost administrate pe geluri de dodecilsulfat de sodiu (SDS)-poliacrilamidă 12% și transferate în membrane de POLIVINILIDENDIFLUORURĂ (PVDF). Membranele au fost blocate cu soluție salină tamponată Tris (TBS) conținând 5% lapte degresat pentru a bloca locurile de legare nespecifice. Membranele au fost incubate cuanti-PI3K (1:1.500) și anti-Akt (1: 1000) (ambele De La Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, Statele Unite ale Americii) și anti-actin (1:500;Sangon Biotech) peste noapte la 4 C. După ce au fost spălate cu 1% Tween-20/PBS, membranele au fost incubate cu secundaranticorpi (Tiangen, Beijing, China) timp de 2 ore la temperatura camerei.Proteinele au fost detectate folosind chemiluminescență îmbunătățită (Vilber, Marne La Vall Unquste, Franța).

analiza statistică

analizele statistice au fost efectuate cu ajutorul software-ului SPSS 19.0. Rezultatele sunt prezentate ca valori medii ale SD. Rezultatele au fostanalizate folosind testul T al elevului sau analiza unidirecțională a varianței(ANOVA). P < 0, 05 a fost considerată semnificativă statistic.

rezultate

curcumina inhibă viabilitatea A549cells

concentrațiile (5, 10, 20 și 40 unktim) și perioadele de timp (12, 24 sau 36 h) de curcumină împotriva celulelor A549 au fost evaluate folosind testul MTT. Fig.2 arată că tratamentul celulelor A549 pentru 12, 24 sau 48 HCU curcumina de 10, 20 și 40 de centimetrii a inhibat viabilitatea celulară în mod adose și dependent de timp. Testul MTT a indicat faptul că tratamentul cu curcumină(20 și 40 de Centimetre) timp de 24 sau 36 de ore a dus la o viabilitate celulară nesemnificativă, comparativ cu grupul martor (Fig. 2).

curcumina induce apoptoza celulelor A549

înainte de tratament, rata apoptotică a celulelor a549 tratate cu curcumină a fost, de asemenea, măsurată. După tratamentul cu curcumină de 20 sau 40 de centimetri timp de 24 de ore, rata apoptotică a crescut semnificativ într-un mod dependent de doză, comparativ cu grupul de control (Fig. 3).

curcumina induce activitatea caspazei-3 a celulelor a549

pentru a determina dacă curcumina induce activitatea caspazei-3 a celulelor a549, activitatea caspazei-3 a fost măsurată folosind kitul de testare a activității acaspase-3. Activitatea caspazei-3 a crescut, de asemeneasemnificativ într-o manieră dependentă de doză după tratamentul cu curcumină (20 sau 40 centimm) timp de 24 de ore, comparativ cu grupul de control(Fig. 4). Aceste rezultate au indicatcă curcumina a indus apoptoza în celulele A549.

miR-192-5p inhibă viabilitatea celulară și induce apoptoza celulelor A549

pentru a examina expresia și semnificația mir-192-5P în celulele epiteliale pulmonare normale umane și în celulele canceroase pulmonare,expresia relativă miR-192-5p a fost detectată utilizând RT-qPCR.Fig. 5A arată că expresia mir-192-5prelativă a celulelor NCL-H460 a fost relativ mai mică, cea a celulelor a549 a fost mai mare, celulele BEAS-2e fiind cele mai exprimate.

pentru a analiza dacă mir-192-5p a influențat viabilitatea celulară și apoptoza celulelor a549, am transfectat miR-192-5pmimics în celule a549. Celulele transfectate cu mir-192-5pmimics au prezentat o creștere semnificativă, de 120 de ori a expresiei miR-192-5p după transfecția 48 h, comparativ cu grupul martor ormiR-NC (Fig. 5B).Supraexprimarea miR-192-5p a scăzut viabilitatea celulelor a549,comparativ cu grupul martor sau mir-NC (Fig. 5C). Cu toate acestea, supraexpresia Demir-192-5p a indus rata apoptotică a celulelor a549, comparativ cu grupul de control sau grupul miR-NC (Fig.5D).

inhibarea miR-192-5p suprimă viabilitatea celulară și induce apoptoza celulelor A549

pentru a determina dacă anti-mir-192-5p a influențat viabilitatea celulelor și apoptoza celulelor a549, am transfectatanti-mir-192-5P imită în celulele A549. Nivelul de Expresie ofmiR-192-5p a fost detectat folosind RT-qPCR după 48 h transfecție.Mimica Anti-miR-192-5p a suprimat efectiv expresia mir-192-5prelativă a celulelor a549 (Fig.6A). Reglarea în jos a miR-192-5p a promovat viabilitatea celulară și a interzis rata apoptotică a celulelor a549, respectiv, comparativ cu grupul de control sau grupul miR-NC (Fig.6B și C).

curcumina inhibă expresia genei miR-192-5p a celulelor A549

pentru a determina dacă curcumina a influențat expresia mir-192-5pgenă a celulelor a549, nivelul de Expresie al miR-192-5p a fost detectat folosind RT-qPCR în urma tratamentului cu curcumină timp de 24 de ore. Fig. 7 arată că nivelul de Expresie al miR-192-5p a fost semnificativ îmbunătățit de curcumină (20 sau 40 de metri cubi).

miR-192-5p inhibă efectul curcuminei asupra viabilității celulare și induce apoptoza celulelor A549

pentru a examina modul în care supraexprimarea mir-192-5p a influențat efectul curcuminei asupra viabilității celulare și rata apoptotică a celulelor a549, am transfectat mimica miR-192-5P în celulele a549. Fig. 8 arată că curcumina a suprimat viabilitatea celulară și a crescut rata apoptotică a celulelor A549 în urma tratamentului cu curcumină (20 MMC) timp de 24 de ore, respectiv, comparativ cu grupul de control. Efectul curcuminei(20 xqtm) asupra viabilității celulare și rata apoptotică a celulelor a549 au fost semnificativ scăzute și crescute de miR-192-5pmimics, respectiv, comparativ cu grupul tratat cu curcumină (Fig. 8A).

inhibarea miR-192-5p suprimă efectul curcuminei asupra viabilității celulare și induce apoptoza celulelor A549

pentru a examina modul în care reglarea descendentă a mir-192-5P a influențat efectul curcuminei asupra viabilității celulare și rata apoptotică a celulelor a549, am transfectat mimici anti-miR-192-5pîn A549 celule. Fig. 9 arată că curcumina a suprimat viabilitatea celulară și a crescut rata apoptotică a celulelor A549 în urma tratamentului cu curcumină (20 MMC) timp de 24 de ore, respectiv, comparativ cu grupul de control. Cu toate acestea, efectul curcuminei (20 centimm) asupra viabilității celulare și rata apoptotică a celulelor a549 au fost semnificativ crescute și reduse prin imitații anti-miR-192-5P, respectiv, comparativ cu grupul tratat cu curcumină (Fig.9A).

curcumina inhibă expresia proteinei PI3K/Akt a celulelor A549

pentru a determina dacă curcumina a afectat expresia PI3K/Aktprotein a celulelor a549, expresia proteinei PI3K/Akt a fost detectată utilizând analiza western blot după tratamentul cu curcumină timp de 24 de ore. 10 demonstreazăcă expresia proteinei PI3K/Akt a fost semnificativ îmbunătățită decurcumină (20 sau 40 de metri cubi).

miR-192-5p vizează direct celulele PI3K/Akt ofA549

pentru a examina modul în care supraexprimarea miR-192-5p a influențat expresia proteinei PI3K/Akt a celulelor a549, wetransfectat mir-192-5p imită în celulele a549. Fig. 11A și B arată că curcumina a suprimat expresiile proteinei PI3K / Akt ale celulelor a549 în urma tratamentului cu curcumină (20 MMC) timp de 24 de ore, comparativ cu grupul de control. Efectul curcuminei (20 centimm) asupra expresiei proteinei PI3K / Akt a celulelor a549 a fost evident redus de mimica mir-192-5p, comparativ cu grupul tratat cu curcumină(Fig. 11C și D).

inhibarea miR-192-5p crește expresia PI3K/Akt a celulelor A549

pentru a determina dacă anti-mir-192-5p a influențat efectul curcuminei asupra expresiei proteinei PI3K/Akt a celulelor a549, wetransfected anti-miR-192-5p imită în celulele a549. Fig. 12A și B arată că curcumina a suprimat expresia proteinei PI3K/Akt a celulelor a549 în urma tratamentului cu curcumină (20 MMC) timp de 24 de ore, respectiv,comparativ cu grupul de control. Cu toate acestea, efectul curcuminei(20 centimm) asupra expresiei proteinei PI3K/Akt a celulelor a549 a fost îmbunătățit semnificativ de mimicii anti-miR-192-5p, respectiv, comparativ cu grupul tratat cu curcumină (Fig.12C și D).

discuție

un milion de pacienți cedează la NSCLC anual la nivel mondial, iar incidența NSCLC este treptat în creștere.Deși o serie de studii din ultimii ani s-au concentrat asupra NSCLC,nu s-au înregistrat progrese mari în ceea ce privește tratamentul. Chirurgia rămâne cea mai eficientă metodă de tratament, dar în ceea ce privește prevenirea, precum și pentru patogeneza NSCLC studii ulterioaretrebuie efectuate (14,15). Recent, Liu și colab identificatcă curcumina inhibă proliferarea și induce în mod semnificativ rata apoptotică a celulelor canceroase gastrice (16). Ma și colab au demonstrat că curcumina inhibă creșterea celulară și invazia celulelor canceroase pancreatice (17). În mod colectiv, constatările noastre au indicat faptul că curcumina a suprimat viabilitatea celulară, a indus apoptoza celulară și a crescut activitatea caspazei-3 a celulelor a549.Prin urmare, curcumina este un medicament potențial pentru oncoterapie.

miARN este o clasă de ARN cu molecule mici care are un rol foarte important în reglarea expresiei genelor, așa cum a fost identificat recent (18). genele miARN suntde obicei localizate în segmente intronice ale genei. Cu toate acestea, miARN-urile sunt distribuite și în afara exonilor necodificatori ai genei și regiunii intergenice, care s-au dovedit a participa la avarietatea căilor ONC ogenice cunoscute, cum ar fi p53, Bcl-2 și K-Ras(19). S-a demonstrat că>50% din miARN-urile umane definite sunt localizate în situsurile fragile ale genomului, iar aceste situsuri fragile sunt adesea asociate cu apariția NSCLC (20). Profilurile de Expresie ale miARN sunt asociate cu dezvoltarea NSCLC. miR-34C, miR-145 și miR-142 pot inhiba NSCLC (5). Rezultatele studiului de față indică faptul că expresia relativă mir-192-5p a celulelor NCL-H460 a fost relativ scăzută, cea a celulelor A549 a fost mai mare, celulele BEAS-2e fiind cele mai exprimate. Supraexprimarea miR-192-5p a scăzut viabilitatea celulară și a crescut rata apoptotică a celulelor a549. Reglarea descendentă a miR-192-5p a crescut viabilitatea celulară și a redus rata apoptotică a celulelor a549.În plus, curcumina a inhibat expresia genei miR-192-5p a celulelor A549. Cu toate acestea, reglarea în sus a expresiei miR-192-5p a sporit efectul curcuminei asupra viabilității celulare și a ratei apoptotice a celulelor a549, în timp ce reglarea în jos a expresiei miR-192-5p a inversat efectul curcuminei asupra celulelor a549. Rezultatele noastre au fost în concordanță cu cele ale altor studii. De exemplu, ye etal a raportat că curcumina promovează apoptoza celulară prin activareamir-192-5p (21). Cu toate acestea, mecanismele probabile privind modul în care curcumina influențează expresia miR-192-5 sunt neclare și ar trebui efectuate studii viitoare pentru a determina acest efect.

în ultimii ani, efectul căii de semnalizare PI3K/Aktsignaling asupra NSCLC uman a câștigat multă atenție(22). Activarea căii de semnalizare PI3K/Akts este foarte frecventă în NSCLC uman, care poate favoriza apariția cancerului printr-o varietate de mecanisme, incluzând mutațiile genei genei supresoare a cancerului Ptenexpresie, mutația sau amplificarea PI3K, mutația Akt sauamplificarea și activarea receptorului oncogen (7). Activarea fiecărei componente a acestei căi este principalul motiv al prognosticului nefavorabil al NSCLC, care poate duce la rezistența la medicament a tratamentului, astfel inhibarea acestei căi poate inversa rezistența la medicament și poate îmbunătăți efectele hemoterapiei și radiațiilor in vivo (23). Datele obținute în prezentstudiul a arătat că curcumina a suprimat expresia proteinei PI3K/Akt a celulelor a549. Reglarea în sus a expresiei miR-192-5p a refăcut expresia proteinei PI3K/Akt a celulelor a549.Reglarea descendentă a expresiei miR-192-5p poate crește expresia PI3K/Aktprotein a celulelor a549. Xu și colab au demonstratcă curcumina inhibă invazia și migrarea celulei FTC133 prin reglarea descendentă a căii de semnalizare PI3K/Akt în celulele canceroase tiroidiene (24). Xu et a sugerat, de asemenea, că curcumina inhibă proliferarea tumorală a cancerului pulmonar prin calea PI3K/Akt (25).Schee și colab a arătat că miR-22-3p, miR-143-3p șimir-192-5p reglementate și au fost implicate în APC, TGF și PI3Kpathway în celulele cancerului colorectal (26).

în concluzie, acest studiu s-a axat pe efectul curcuminei împotriva celulelor A549, a inhibat proliferarea celulară și a indus apoptoza NSCLC umană prin reglarea în sus Amir-192-5P și suprimarea căii de semnalizare PI3K/Akt. Concluzia studiului de față indică faptul că curcumina este o țintă potențială în tratamentul NSCLC. Cu toate acestea, studiul de față a relevat unele limitări, deoarece nu am examinat relația detaliată dintre mir-192-5P și calea PI3K/Akt în celulele canceroase pulmonare. Pentru a verifica rezultatele, trebuie efectuate studii suplimentare in vivo, analize statistice clinice și la scară mai largă ale prezentului studiu.