Oncologia Relatórios

Introdução

o câncer de Pulmão é um tumor maligno com o highestmorbidity e mortalidade em todo o mundo, e sua incidência é no theincrease. Aproximadamente 80% da doença pode ser atribuída ao câncer de pulmão de pequenas células tonon (NSCLC) (1). Devido às limitações das técnicas de diagnóstico auricular e à falta de infestações clínicas específicas precoces, 70 a 80% dos pacientes são diagnosticados em estadios avançados(2). Por conseguinte, a identificação de um tratamento seguro e eficaz da toxicodependência para o CPNPC é crucial.

os resultados recentes demonstraram que a incidência,o desenvolvimento e a transferência do CPNPC não são apenas influenciados por factores genéticos, mas que a alteração epigenética também é importante,incluindo o pequeno ARN molecular (ncRNA) (3). MicroRNA(miRNA), uma classe de endogenoussmall ncRNA com um comprimento de ~21-25 bases, amplamente existentes ineukaryotes, pode identificar o ARNm de um gene alvo específico (4). Mais de 50% dos genes miRNAs estão mapeados em locais frágeis ou regiões genômicas relacionadas ao NSCLC,sugerindo que a expressão miRNA pode estar intimamente associada ao NSCLC. Como relatado, a expressão de um grande número de miRNAs inNSCLC mostram desordem e o desequilíbrio das miRNAs promovem a depressão do ciclo celular NSCLC, efeito anti-apoptótico, invasão de células aumentadas e metástase do cancro do pulmão de células não Pequenas(5).

a via sinalizadora PI3K/Akt desempenha um importante papel na sobrevivência celular mediada pelo factor de crescimento. Os resultados anteriores demonstraram que a perturbação da via PI3K/Akt/mTOR pode desempenhar um papel importante na formação do CPNPC (6). Também foi relatado que o sinal de proliferação celular gerado pela combinação de uma série de receptores e ligandos transmembranares pode ativar a signaltransdução de PI3K/Akt/mTOR, que está intimamente associado com o estado de proliferação e sobrevivência do NSCLC (7). Estes receptores incluem receptores c-met,receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), c-kit e receptor do factor de crescimento insulina-likegrowth (IGF-IR).

a curcumina é um ingrediente activo natural extraído do rizoma seco do género Curcuma plant, turmeric e curcuma, com efeitos farmacológicos extensos, baixa toxicidade e tolerância alimentar e, devido ao seu valor económico, tornou-se um ponto quente para exploração (8). Os resultados de estudos centrados na curcumina identificaram uma vasta gama de actividades farmacológicas,tais como anti-inflamação, anti-oxidação, lípidos, anti-vírus, anti-infecção,anticanceroso, anticoagulante, fibrose hepática e aterosclerose, baixa oxidação e poucos efeitos secundários (9-13).No entanto, o efeito da curcumina no CPNPC e no mecanismo olecular subjacente permanece incerto. No presente estudo, os weexamined the anticancer effect of curcumin on cell proliferation and apoptosis of human NSCLC and identified a possible relationship between this effect and the miRNA-192-5p-modulated PI3K / Akt signaling pathway.

materiais e métodos

produtos químicos

Dulbecco modificated Eagle’s medium (DMEM) and fetalcalf serum (FBS) were purchased from Gibco (Carlsbad, CA, USA) and(South America). O brometo de 3-(4,5-dimetil-tiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazólio(MTT) foi comprado da Sangon Biotech (Xangai, China). O kit De Detecção de apoptose I foi comprado fromBD Biosciences (San Jose, CA, EUA). A atividade caspase-3 assaykit foi comprada da Promega (Madison, WI, EUA).

cultura de células

normal humana NCL-H460 e epiteliais pulmonares BEAS-2E, e células humanas de cancro do pulmão A549 foram obtidas a partir do centro de fontes celulares da segunda universidade militar de Medicina. Estas células foram cultivadas em DMEM, completadas com 10% de FBS (ambos de fromGibco), 100 U/ml de penicilina e 100 µg/ml de estreptomicina a 37°C e uma incubadora de humidifídeos com 5% de CO2. Foram examinadas as concentrações (5,10,20 e 40 µM) e os períodos (12 e 24 h) de curcumina contra A549 células. A estrutura química da curcumina é apresentada na figura.1.

análise de viabilidade celular

as células foram semeadas a uma densidade de 5×103/poço em placas de 96 poços. Em resumo, a viabilidade celular foi medida pelo ensaio MTT (Sangon Biotech). Foram adicionados dez microlitros MTT (5mg/l) em cada poço e incubados durante 4 h a 37°C numa incubadora humidificada com 5% de CO2. Sulfóxido de dimetilo (150 µl); Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foram adicionados a cada poço e agitados por 20 minutos na temperatura ambiente. A absorvância foi medida a 450 nM utilizando um leitor de amicroplatos.

Annexin V-FITC/propidium iodide (PI)apoptosis analysis

Cells were seed at a density of1×106/well in 6-well plates. As células cultivadas foram lavadas duas vezes com PBS a frio com gelo e, em seguida, manchadas com o anexo Em V-FITC e com o kit de detecção de apoptose i, de acordo com as instruções do fabricante (Biociências BD). Apoptose foi analisada através de flowcytometric usando o software CellQuest Pro (IVD) (ambos de BDBiosciences).

Análise de ativação da Caspase-3

as células foram semeadas com uma densidade de 5×103/alvéolo em placas de 96 alvéolos. A actividade da Caspase – 3 foi medida utilizando um kit de ensaio de actividade da caspase-3 de acordo com as instruções do fabricante (Promega). Cem microlitersreaction buffer com 10 µl de substrato Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroaniline (pNA) foi adicionado 10 µl de proteincell lisado/poço e incubadas a 37°C por 6 h. Caspase-3 activitywas analisados em uma absorvância de 405 nm.

transfecção celular

o miR-192-5p, anti-miR-192-5p e controle negativo (miR-NC) foram todos comprados da Sangon Biotech. As células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até 50% a 60% da confluência da transfecção antes do nascimento. Os mímicos foram transferidos com Lipofectamina 2000 para células de acordo com as instruções do fabricante(Invitrogen Life Technologies). Gene ou proteína foi isolado 24 transfecção de hafter e usado para transcrição reversa-reação em cadeia quantitativa-polimerase (RT-qPCR) ou análise western blot,respectivamente.

RT-qPCR

as células foram semeadas a uma densidade de 5×103/poço em placas de 96 poços. O RNA Total foi extraído das células utilizando reagente de TRIzol (tecnologias de vida do Invitrogénio).A concentração RNA foi determinada utilizando um espectrofotómetro ND-1000 Nd-NanoDrop®(Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington,DE, USA). A quantificação dos miRNAs foi realizada com o kit de ensaio bya TaqMan miRNA (Applied Biosystems, Foster City,CA, EUA). O RNA Total foi submetido à síntese cDNA de primeira linha e examinado usando um kit de reagente RT PrimeScript (ambos De Takara,Shiga, Japão). o qPCR foi realizado usando SYBR-Green PCR Master Mix (Takara) no sistema ABI 7500HT. Os primers usados na thereactions são mostradas na Tabela I.

Tabela I PCR primers usados na thereactions.

a análise de manchas ocidentais

células foram semeadas a uma densidade de 5×103 / poço em placas de 96 poços. As células cultivadas foram lavadas duas vezes com PBS gelado e incubadas com tampão de lise gelado durante 30 minutos no gelo. O líquido celular foi recolhido e centrifugado a 12 000 × g durante 10 minutos a 4 ° C. A concentração de proteínas solúveis foi determinada utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Sigma, St.Louis, MO,EUA). As proteínas totais (10 µg) foram administradas em 12% de géis dodecilsulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida e transferidas para membranas de polivinilidenodifluoreto (PVDF). As membranas foram bloqueadas com soro salino com tampão tris (TBS) contendo 5% de leite não gordo para locais de ligação específicos de blocknon. As membranas foram incubadas comanti-PI3K (1:1.500) e anti-Akt (1: 1000) (ambas de Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA) e anti-β-actina (1:500;Sangon Biotech) durante a noite a 4 ° C. Depois de serem lavadas com 1% Tween-20/PBS, as membranas foram incubadas com os corpos secundários (Tiangen, Pequim, China) por 2 h à temperatura ambiente.As proteínas foram detectadas utilizando quimioluminescência melhorada (Vilber, Marne La Vallée, França).

análise estatística

análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS 19.0. Os resultados são apresentados como média ± DP. Os resultados foram analisados utilizando o teste t do aluno ou a análise de Sentido Único da variância(ANOVA). P <0, 05 foi considerado estatisticamente significativo.Os resultados de

os resultados de

a curcumina inibe a viabilidade da A549cells

as concentrações (5, 10, 20 e 40 µM) e os períodos de tempo (12, 24 ou 36 h) de curcumina contra as células A549 foram avaliados utilizando o ensaio MTT. Figo.2 mostra que o tratamento de células A549 para 12, 24 ou 48 HCOM 10, 20 e 40 µM de curcumina inibiu a viabilidade celular de forma dependente da dose e do tempo. O ensaio MTT indicou que o tratamento com curcumina (20 e 40 µM) durante 24 ou 36 h resultou numa viabilidade celular insignificante em comparação com o grupo de controlo(Fig. 2).

a curcumina induz apoptose das células A549cells

antes do tratamento, a taxa apoptótica das células A549 tratadas com curcumina (10, 20 ou 40 µM) foi também submetida a cura. Após o tratamento com curcumina de 20 ou 40 µM durante 24 h, a taxa apoptótica aumentou acentuadamente num homem dependente da dose, em comparação com o grupo de controlo (Fig. 3).

a curcumina induz a actividade da caspase-3 das 549 células

para determinar se a curcumina induz a caspase-3actividade das células A549, a actividade da caspase-3 foi medida utilizando o kit de ensaio de actividade da acaspase-3. A actividade da Caspase-3 também aumentou significativamente de forma dependente da dose após tratamento com curcumina (20 ou 40 µm) durante 24 horas, em comparação com o grupo de controlo(Fig. 4). Estes resultados indicavam que a curcumina induzia apoptose em células A549.

miR-192-5p inibe a viabilidade celular e induz a apoptose de A549 células

para examinar a expressão e o Significado de Mir-192-5p em células do cancro do pulmão epitelial e normal humano,a expressão relativa miR-192-5p foi detectada usando RT-qPCR.Figo. 5-a mostra que a expressão pré-lativa miR-192-5 das células NCL-H460 era relativamente menor, a de 549 células era maior, com as células BEAS-2E sendo as mais altas expressas.

para analisar se miR-192-5p influenciou a capacidade celular e a apoptose das células A549, transferimos miR-192-5pmimics para as células A549. As células transfectadas com miR-192-5pmimics mostraram um aumento significativo, 120 vezes superior no miR-192-5pexpressão após transfecção de 48 h, em comparação com o grupo controle ormiR-NC (Fig. 5B).A sobreexpressão do miR-192-5p diminuiu a viabilidade das células A549, em comparação com o grupo controlo ou miR-NC(Fig. 5C). No entanto, a sobreexpressão de Mir-192-5p induziu a taxa de A549 células, em comparação com o grupo controlo ou miR-NC (Fig.5D).

Inibição do miR-192-5p suprime cellviability e induz a apoptose das células A549

Para determinar se o anti-miR-192-5p influenciado thecell viabilidade e a apoptose de células A549, nós transfectedanti-miR-192-5p imita em células A549. O nível de expressão ofmiR-192-5p foi detectado usando RT-qPCR após transfecção de 48 h.Anti-miR-192-5p mimics effectively suppressed the miR-192-5prelative expression of A549 cells(Fig.6A). A baixa regulamentação do miR-192-5p promoveu a viabilidade celular e proibiu a taxa de A549 células, respectivamente, em comparação com o grupo controlo ou miR-NC (Fig.6B e C).

a curcumina inibe a geneexpressão miR-192-5p de A549 células

para determinar se a curcumina influenciou a expressão miR-192-5pgeno de A549 células, o nível de expressão de miR-192-5P foi detectado utilizando RT-qPCR após tratamento com curcumina durante 24 horas. Fig. 7 mostra que o nível de expressão do miR-192-5p foi acentuadamente aumentado pela curcumina (20 ou 40µM).

miR-192-5p inibe o efeito ofcurcumin na viabilidade celular e induz a apoptose das células A549

Para examinar como a sobre-expressão de miR-192-5pinfluenced o efeito da curcumina sobre a viabilidade celular e theapoptotic taxa de células A549, nós transfected miR-192-5p imita intoA549 células. Figo. 8 mostra que acurcumina suprimiu a viabilidade celular e aumentou a taxa apoptótica de A549 células após tratamento com curcumina (20 µM) durante 24 h, respectivamente, em comparação com o grupo de controlo. O efeito dacurcumina (20 µM) na viabilidade celular e na taxa apoptótica de 549 células foram significativamente diminuídos e aumentados em miR-192-5pmímicos, respectivamente, em comparação com o grupo tratado com curcumina(Fig. 8A).

Inibição do miR-192-5p suprime theeffect de curcumina na viabilidade celular e induz a apoptose de A549cells

Para examinar como a downregulation de miR-192-5pinfluenced o efeito da curcumina sobre a viabilidade celular e theapoptotic taxa de células A549, nós transfected anti-miR-192-5p mimicsinto células A549. Figo. 9 mostra que acurcumina suprimiu a viabilidade celular e aumentou a taxa apoptótica de A549 células após tratamento com curcumina (20 µM) durante 24 h, respectivamente, em comparação com o grupo de controlo. No entanto, o efeito da curcumina (20 µM) na viabilidade celular e na taxaapoptótica das células A549 foram acentuadamente aumentados e reduzidos pelos mímicos anti-miR-192-5p, respectivamente, em comparação com o grupo tratado com acurcumina (Fig.9A).

a curcumina inibe a proteinexpressão PI3K/Akt das células a549

para detectar se a curcumina afectou a expressão PI3K/Aktproteína das células A549, a expressão proteica PI3K/Akt foi detectada através da análise western blot após tratamento com curcumina durante 24 horas. Fig. 10 mostra que a expressão proteica PI3K/Akt foi acentuadamente aumentada pela turcumina (20 ou 40 µM).

miR-192-5p tem como alvo directo PI3K/Akt das células a549

para examinar como a sobreexpressão do miR-192-5pinfluenciou a expressão proteica PI3K / Akt das células A549, o miR-192-5p wetransfectado em células A549. Figo. 11A e B mostram que o curcuminsupressou as expressões proteicas PI3K/Akt de A549 células que seguem tratamento com curcumina (20 µM) por 24 h, em comparação com o grupo de controlo. O efeito da curcumina (20 µM) na expressão proteica de ipi3k/Akt das células A549 foi evidentemente reduzido por mímicos de cimir-192-5p, em comparação com o grupo tratado com curcumina(Fig. 11C E D).

Inibição do miR-192-5p aumenta thePI3K/Akt expressão de células A549

Para determinar se o anti-miR-192-5p influenciado theeffect de curcumina em PI3K/Akt expressão de proteínas de células A549, wetransfected anti-miR-192-5p imita em células A549. Figo. 12A e B mostram que o curcuminsupressed the PI3K/Akt protein expression of a549 cells followingingtrated with curcumin (20 µM) for 24 h, respectively,compared with the control group. No entanto, o efeito da curcumina(20 µM) na expressão proteica de PI3K/Akt das células A549 foi claramente melhorado por mimetismo anti-miR-192-5p, respectivamente, em comparação com o grupo tratado com curcumina (Fig.12C e D).

discussão

um milhão de doentes sucumbem ao CPNPC a nível mundial, e a incidência do CPNPC está gradualmente a aumentar.Embora alguns estudos nos últimos anos tenham incidido no CPNPC, não se registaram grandes progressos no que respeita ao tratamento. A cirurgia continua a ser o método de tratamento mais eficaz, mas em termos de prevenção, bem como para a patogenese do NSCLC é necessário realizar mais estudos (14,15). Recentemente, Liu et al identificou que a curcumina inibe a proliferação e induz significativamente a taxa apoptótica das células cancerígenas gástricas (16). A Ma et al demonstrou que a curcumina inibe o crescimento celular e a invasão de cancercells pancreáticos (17). Coletivamente, ourfindings indicou que a curcumina suprimiu a viabilidade celular, induziu a apoptose da célula e aumentou a atividade da caspase-3 das células A549.Portanto, curcumin é uma droga potencial para oncoterapia.

miRNA é uma classe de RNA de pequenas moléculas que tem um papel muito importante na regulação da expressão genética, tal como recentemente identificado (18). os genes miRNA estão usualmente localizados em segmentos intron do gene. No entanto, as miRNAs também são distribuídas fora dosexões não codificadores do gene e da região intergénica, que se verificou participarem numa variedade de vias ONC ogénicas conhecidas, tais como p53, Bcl-2 e K-Ras(19). Foi demonstrado que >50% dos miRNAs humanos definidos se encontram nos sítios frágeis do genoma e que estes sítios frágeis estão frequentemente associados à ocorrência do cancro do pulmão (20). Os perfis de expressão dos miRNAs estão associados ao desenvolvimento do CPNPC. o miR-34c, o miR-145 e o miR-142 podem inibir o NSCLC (5). Os resultados do presente estudo indicam que a expressão relativa miR-192-5p das células NCL-H460 era relativamente baixa, a de A549 células era mais elevada, sendo as células BEAS-2E as mais expressadas. A sobreexpressão da miR-192-5P diminuiu a viabilidade celular e aumentou a taxa apoptótica de 549 células. A diminuição da regulação da miR-192-5p aumentou a capacidade celular e reduziu a taxa apoptótica das células A549.Adicionalmente, a curcumina inibiu a expressão do gene miR-192-5p de A549cells. No entanto, a upregulation do miR-192-5p expressão enhancedthe efeito da curcumina sobre a viabilidade celular e a apoptótico taxa de ofA549 células, enquanto a downregulation de miR-192-5p expressionreversed o efeito da curcumina em células A549. Os nossos resultados foram consistentes com os de outros estudos. Por exemplo, Ye etal relatou que a curcumina promove a apoptose celular por ativatingmir-192-5p (21). No entanto, os mecanismos susceptíveis de determinar a forma como a curcumina influencia a expressão miR-192-5 não são claros e devem ser realizados estudos futuros para determinar este efeito.

nos últimos anos, o efeito da Via De Sinalização PI3K/Akt no CPNPC humano ganhou muita atenção (22). A activação da Via De Sinalização PI3K/Akt é muito comum no CPNPC humano, que pode promover a ocorrência de cancro através de uma variedade de mecanismos, incluindo mutações de geno, redução da expressão do gene supressor do cancro, mutação ou amplificação PI3K, mutação ou amplificação Akt e activação do receptor de oncogeno (7). A activação de cada componente desta via é a principal razão para o prognóstico desfavorável do CPNPC,que pode levar à resistência ao fármaco do tratamento, pelo que a inibição desta via pode reverter a resistência ao fármaco e melhorar a terapia e os efeitos da radiação in vivo (23). Os dados obtidos no presente estudo revelaram que o curcumin suprimiu a proteinexpressão PI3K/Akt das células A549. A regulação da expressão miR-192-5preferiu a expressão proteica PI3K/Akt das células A549.A regulamentação da expressão miR-192-5p pode aumentar a expressão PI3K/Aktprotein das células A549. Xu et al demonstraram que a curcumina inibe a invasão e migração de FTC133 através da regulamentação da via de sinalização PI3K/Akt nas células de tiroidcancer (24). Xu et alsuggested that curcumin inibe a proliferação tumoral de cancer pulmonar através da via PI3K / Akt (25).Schee et al revelou que o miR-22-3p, o miR-143-3p andmiR-192-5p regularam e estiveram envolvidos no APC, TGFß e PI3Kpathway nas células do cancro colorectal (26).

em conclusão, este estudo centrou-se no efeito da curcumina contra as células A549, inibiu a proliferação celular e induziu a apoptose do CPNPC humano através da regulação de Mir-192-5p e da supressão da via sinalizadora de PI3K/Akt. As conclusões do presente estudo indicam que a curcumina é um alvo potencial no tratamento das CPNPC. No entanto, o estudo apresentado revelou algumas limitações, uma vez que não examinámos a relação detalhada entre miR-192-5p e a via PI3K/Akt nas células de lungcancer. Estudos adicionais in vivo, clínicos e de maior escala do presente estudo devem ser realizados para verificar os resultados.