afinitatea hemoglobinei pentru oxigen în trei subspecii de broaște (Bufo sp.) condiții de viață la diferite altitudini
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratorio de transporturi de Okscartgeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, pe Okscart
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
rezumat
afinitatea oxigenului din sânge și proprietățile celulelor roșii din sânge au fost măsurate în trei subspecii din genul bufo: bufo spinulosus limensis, colectate la nivelul mării și la o temperatură medie a zilei de 20 Inqqc; Bufo spinulosus trifolium, de la 3100 m, Temperatura medie a zilei de 15 XCT; și Bufo spinulosus flavolineatus, de la 4100 m, Temperatura medie a zilei de 10 XCTC. Electroforeza hemoglobinei a arătat aceeași componentă în fiecare dintre cele trei subspecii. La 20 de CENTICCI, afinitățile oxigenului din sânge (P50) au prezentat mici diferențe între Bufo spinulosus limensis și Bufo spinulosus trifolium, în timp ce valoarea pentru Bufo spinulosus flavolineatus a fost semnificativ mai mică. La 10 CENTICC, temperatura ambiantă a Bufo spinulosus flavolineatus, P50 A fost extrem de scăzută în comparație cu celelalte două subspecii la temperaturile ambiante corespunzătoare.
cuvinte cheie: adaptări, altitudine, amfibieni, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, afinitate hemoglobină, hematocrite, legare de oxigen, broaște
introducere
în Peru genul Bufo ocupă un gradient altitudinal variind de la nivelul mării până la peste 4000 m. Specia Bufo spinulosus are trei subspecii ale căror nișe sunt la altitudini mici, intermediare și mari. Aceste subspecii sunt Bufo spinulosus limensis (altitudine mică), Bufo spinulosus trifolium (altitudine intermediară) și Bufo spinulosus flavolineatus (altitudine mare) (12). Una dintre cele mai intens studiate adaptări de mediu ale sistemului respirator la vertebrate este cea a hipoxiei, care apare diferit la altitudine mare, în dezvoltarea embrionară (de exemplu, in utero) și în medii acvatice, în special în apă dulce. Aceste adaptări implică în mod obișnuit modificări ale proprietăților celulelor roșii, ale capacității de transport a oxigenului sau ale afinității oxigenului din hemoglobină. Adaptările intraspecifice, care apar la același animal în condiții diferite, implică în general modificări ale factorilor alosterici (adică condițiile în care hemoglobina funcționează în interiorul celulelor roșii), în timp ce adaptările interspecifice, care sunt evidente atunci când se compară diferite specii, sunt atribuibile modificărilor proprietăților moleculelor de hemoglobină.
majoritatea studiilor privind adaptările hipoxice în proprietățile celulelor roșii și hemoglobinei se referă la pești și mamifere și se cunosc foarte puține despre vertebratele ectotermice inferioare. Un studiu anterior a arătat că broasca lacului Titicaca Telmatobius culeus (2) care trăia la 3800 m. avea o afinitate mai mare de sânge O2 și celule sanguine mai mici decât broaștele de la nivelul mării. Acest studiu descrie adaptările la subspecia Bufo.
MATERIAL și metode
Anuranii din subspecia Bufo spinulosus limensis au fost colectați din câmpiile de coastă la aproximativ 400 km de laboratorul nostru din Lima (nivelul mării, temperatura medie a Zilei 20 UNKTOCC). Bufo spinulosus trifolium au fost colectate în Anzii peruani centrali (aproximativ 3100 m, Temperatura medie a Zilei 15 XQQC), și Bufo spinulosus flavolineatus, de asemenea, în Anzii centrali (la 4100 m, Temperatura medie a Zilei 10 XQQC). Animalele au fost aduse la laboratorul nostru în câteva ore. Sângele a fost extras în seringi heparinizate din inimile animalelor cu sâmburi anterioare. Aproximativ 3 ml de sânge ar putea fi obținut din Bufo spinulosus limensis și 1 până la 1, 5 ml din celelalte subspecii. Sângele de la două la trei animale a fost colectat pentru a efectua determinările. Numărul de celule roșii din sânge, concentrația hemoglobinei și hematocritele au fost măsurate prin tehnici convenționale.
electroforeza hemoglobinei a fost executată pe benzi de acetat de celuloză într-un tampon specific pentru electroforeza hemoglobinei, iar benzile au fost colorate cu Ponceau S și citite într-un densitometru conform Manualului de instrucțiuni Helena Laboratories (SUA).
afinitatea sânge-oxigen (P50) A fost măsurată prin tehnica de amestecare (1,10) la 10, 15 și 20, 15 și 20. Echilibrarea sângelui a fost efectuată într-un tonometru menținut la aceste temperaturi folosind amestecuri de gaze conținând 4,5% CO2 și concentrații variabile de O2 și N2. Saturația sângelui O2 a variat între 30 și 80%. PH-metru a fost calibrat folosind tampoane fosfat de înaltă precizie.
valorile pH-ului la temperaturile de echilibru (eq) au fost calculate din cele la temperaturile de măsurare (meas) folosind ecuația dată de Rosenthal (8):
pHeq = pH-uri + 0,0147 (Teq _ Tmeas)
factorul Bohr a fost obținut prin modificarea pH-ului sanguin după cum urmează. Plasma preparată din alicote sanguine a fost fie acidificată cu acid lactic, fie alcalinizată cu hidroxid de sodiu și reconstituită cu globulele roșii corespunzătoare. Probele de sânge de la Bufo spinulosus limensis și Bufo spinulosus trifolium s-au echilibrat la 20 și 15, iar sângele de la Bufo spinulosus flavolineatus la 20 și 10, respectiv la diferite valori ale pH-ului, în vederea calculării factorului Bohr pentru fiecare temperatură (14). Acest factor a permis calcularea pH-ului standard al sângelui la cele trei temperaturi. Pentru a calcula coeficientul lui Hill (N), A fost utilizată o metodă de aproximări succesive (10). O valoare din ecuația Bohr pentru fiecare subspecie a fost calculată din date în experimente separate.
ecuația van’ t Hoff a fost utilizată pentru a calcula căldura totală de oxigenare DH ‘ din valorile P50. Pentru Bufo spinulosus limensis s-au folosit valori de 20 si 15, luand ca temperatura ambianta 20. Pentru Bufo spinulosus trifolium s-au utilizat valori de 15 și 20 de CENTICC, luând ca temperatură ambiantă 15 CENTICC. Pentru Bufo spinulosus flavolineatus s-au folosit valori de 10 și 20 de CENTICC luând ca temperatură ambiantă 10 CENTICC. Semnificația statistică a fost determinată de testul T al elevului cu software-ul Systat 6.0 Pentru Windows.
rezultate
tabelele I și II rezumă datele hematologice. Nu există nicio diferență statistică între valorile Bufo spinulosus limensis și Bufo spinulosus trifolium. Valorile hematocritului, hemoglobinei și cantității de RBC în Bufo spinulosus flavolineatus sunt mult mai mici.
experimentele de electroforeză au arătat aceleași distanțe de migrare în hemoglobinele fiecăreia dintre cele trei subspecii și prezența a două benzi în unele dintre alergări (Fig. 4). Nu s-au efectuat studii suplimentare pentru a defini proprietățile hemoglobinei.
tabelul II prezintă proprietățile funcționale ale hemoglobinei în sânge, evidențiind mici diferențe în P50 între Bufo spinulosus limensis și Bufo spinulosus trifolium, în timp ce valoarea pentru Bufo spinulosus flavolineatus este mai mică. Valorile la temperatura ambiantă la care au fost colectate animalele nu au diferit semnificativ între Bufo spinulosus limensis și Bufo spinulosus trifolium. În cazul Bufo spinulosus flavolineatus, la 10 CENTICC valoarea P50 este foarte scăzută. Figura 1 prezintă un grafic al Jurnalului P50 vs. pH.Figura 2 prezintă curbele de disociere a oxigenului hemoglobinei construite cu valorile P50 și coeficientul lui Hill la 20 C. curbele pentru Bufo spinulosus limensis și Bufo spinulosus trifolium sunt foarte apropiate una de cealaltă, în timp ce cea pentru Bufo spinulosus flavolineatus este deplasată spre stânga. Figura 3 este un grafic al conținutului de sânge O2 vs. sânge PO2 la temperatura ambiantă a fiecărei subspecii. Aceasta arată conținutul scăzut de O2 și P50 foarte scăzut al Bufo spinulosus flavolineatus și o deplasare moderată la stânga Bufo spinulosus trifolium comparativ cu Bufo spinulosus limensis, fără reducerea conținutului de O2 din sânge în Bufo spinulosus limensis și Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1: efect Bohr în trei subspecii de Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus prezintă cel mai mare factor Bohr.
Fig. 2: curba de disociere a sângelui pentru cele trei subspecii la pH de 7,84 și 20 C. Curba Bufo spinulosus flavolineatus este deplasată spre stânga.
Fig. 3: Conținutul de hemoglobină O2 vs presiunea parțială a oxigenului pentru fiecare subspecie la temperatura ecologică respectivă. Bufo Spinulosus limensis( 20 XCT), Bufo spinulosus trifolium (15 XCT)Bufo spinulosus flavolineatus (10 XCT). Conținutul de hemoglobină al Bufo spinulosus flavolineatus este mai mic decât în celelalte două subspecii, iar P50 este foarte scăzut.
Fig. 4: electroforeza celor trei subspecii de Bufo Spinulosus. Experimentul arată aceleași distanțe de migrații în hemoglobinele fiecăreia dintre cele trei subspecii și prezența a două benzi în unele dintre alergări.
aceste rezultate arată că la 20 de centimetrii Bufo spinulosus flavolineatus, al cărui habitat natural este aproape de 4000 m și a cărui temperatură ambientală este în medie de 10 centimetrii, are un conținut scăzut de hemoglobină și o afinitate mare de hemoglobină în comparație cu Bufo spinulosus trifolium, a cărui altitudine medie ambientală este aproape de 3000 m și a cărei temperatură medie ambientală este de 15 centimetrii. Bufo spinulosus limensis (nivelul mării) și Bufo spinulosus trifolium aveau curbe aproape identice. Dacă curbele au fost obținute la temperaturile ambientale, Bufo spinulosus flavolineatus a prezentat un conținut foarte scăzut de O2 și o afinitate ridicată a hemoglobinei în comparație cu celelalte două subspecii. În Bufo spinulosus flavolineatus, DH ‘ ridicat indică o sensibilitate ridicată a afinității hemoglobinei la modificările temperaturii ambiante, iar factorul Bohr ridicat indică, de asemenea, o sensibilitate ridicată a afinității hemoglobinei la modificările pH-ului sanguin.
discuție
genul Bufo este răspândit în țările andine. Bufo spinulosus are trei subspecii ale căror nișe sunt situate în versanții Andini inferiori, văile intermediare (3000 m) și cele mai înalte câmpii (peste 4000 m). Subspecia de altitudine intermediară Bufo spinulosus trifolium și subspecia nivelului mării Bufo spinulosus limensis nu diferă în ceea ce privește valorile lor hematologice. Bufo spinulosus flavolineatus de mare altitudine are o concentrație de hemoglobină mult mai mică, dar caracteristicile celulelor roșii sunt similare cu celelalte două subspecii. RBC-urile par a fi mai mici decât cele din celelalte două subspecii, spre deosebire de descoperirile lui Ruiz (9), care au indicat contrariul. Se știe că genul Bufo are o concentrație mai mare de hemoglobină decât alți amfibieni. Hutchinson și Szarki (3) atribuie acest lucru vascularizării ridicate și obiceiului terestru. Cu toate acestea, Bufo spinulosus flavolineatus are o concentrație foarte mică de hemoglobină.
în cele trei grupuri, studiul electroforetic al hemoglobinei arată indivizii al căror model electroforetic prezintă două benzi de hemoglobină clar separate. Nu există nici o diferență în afinitatea hemoglobinei între Bufo spinulosus trifolium și Bufo spinulosus limensis la 20 CENTICC, în timp ce în Bufo spinulosus flavolineatus este mai mare. Când afinitățile au fost studiate la temperaturile ambientale în care trăiesc animalele, Bufo spinulosus trifolium a avut curbe de disociere a oxigenului care s-au deplasat moderat spre stânga Bufo spinulosus limensis, iar Bufo spinulosus flavolineatus a prezentat o schimbare foarte marcată, indicând o afinitate foarte mare a hemoglobinei.
mamiferele și păsările native de mare altitudine tind să aibă afinități ridicate de oxigen din sânge și să nu prezinte policitemie la altitudine mare (5). Ar fi interesant de observat dacă aceste răspunsuri la hipoxia ambientală și condițiile reci sunt prezente la animalele ectotermice. În teorie, condițiile reci ar trebui să contribuie la creșterea toleranței la altitudine mare, deoarece scade rata metabolică. În cazul Bufo spinulosus flavolineatus, a cărui temperatură de zi sub roci la 4100 m este de aproximativ 10 CENTICC și aproximativ 6 CENTICC sau mai puțin noaptea în iazurile în care se odihnesc pe jumătate scufundate, afinitatea ridicată indică presiunea de selecție spre hipoxie, în ciuda unei posibile reduceri a ratei metabolice. Packard și Stiverson (7) nu au găsit o relație între altitudine și concentrația hemoglobinei în broasca corului (Pseudacris triseriata), dar intervalul de altitudine din studiul lor (1500 m și 3000 m) a fost mic.
afinitatea hemoglobinei este un semn genetic aparent selectat de mediul hipoxic la vertebrate. La mamifere și păsări afinitatea este o proprietate destul de fixă care nu crește în hipoxie și nu dispare în normoxia (6). La pești, pe de altă parte, oxigenul din sânge crește semnificativ sub hipoxie (13).
din punct de vedere comparativ, există unele asemănări între ectoterme și endoterme. S-a constatat că există o anumită corelație între afinitatea hemoglobinei și altitudine la subspecii șoarecilor care ocupă un gradient altitudinal (11). De asemenea, s-a demonstrat că în cadrul aceleiași specii de mamifere care trăiesc de-a lungul unui gradient vertical în Anzi, indivizii care trăiesc în cel mai înalt interval au hemoglobine cu afinitate mai mare decât indivizii care trăiesc în cel mai mic interval. Aceste diferențe au fost mai mari în cazul vulpii Andine, unde două specii separate ocupă cele două extreme ale intervalului de altitudine (4).
această lucrare consolidează conceptul că policitemia nu este selectată ca parametru adaptiv la mediul hipoxic. Dimpotrivă, hemoglobina cu afinitate ridicată pare a fi puternic selectată într-o varietate de animale care trăiesc la altitudine mare.
mulțumiri
îi mulțumim Dr.Roy E. Weber pentru ajutorul său în clarificarea gândirii noastre asupra acestui subiect și pentru revizuirea manuscrisului.
Autor Corespondent: Hrvoj Ostojic P. – Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Telefon: (56-57) 420599, Fax: (56-57) 427683, e-mail: [email protected]
primit: 13 August 1999. Acceptat în formă revizuită: 6 mai 2000
bibliografie
1. EDWARDS MJ, MARTIN RJ (1966). Tehnica de amestecare pentru echilibrul oxigen-hemoglobină și efectul Bohr. J Appl Physiol 21:1898-1902
2. HUTCHINSON VH, HAINES HB, ENGEBRETSON G (1976) viața acvatică la altitudine mare: adaptări respiratorii în broasca lacului Titicaca, Telmatobius culeus. Respir Physiol 2: 115-119.
3. HUTCHINSON VH, SZARSKI H (1965) numărul de eritrocite în unele amfibieni și reptile. Copeia: 373-375
4. LEON-VELARDE F, de MUIZON C, PALACIOS JA, CLARK D, MONGE-C C (1996) afinitatea și structura hemoglobinei la carnivorele de mare altitudine și la nivelul mării din Peru. Comp Biochem Physiol 113A:407-411
5. MCCUTCHEON FH HALL FG (1937) hemoglobină în amfibie. J Cell & Comp Physiol 9:191-197
6. MONGE C, LEON-VELARDE F (1991) adaptarea fiziologică la altitudine mare: transportul oxigenului la mamifere și păsări. Physiol Rev 71: 1135-1172
7. PACKARD G C STIVERSON RK (1976) concentrația hemoglobinei din sânge în broasca corului (Pseudacris triseriata): relația cu dimensiunea corpului și altitudinea. Am Midl Nat 96: 482-487
8. Rosenthal TB (1948) efectul temperaturii asupra pH-ului sângelui și plasmei in vitro. J Biol Chem 173:25-30
9. RUIZ G, ROSENMANN M, VELOSO A. (1989) distribuția altitudinală și valorile sângelui în broască, Bufo spinulosus Wiegmann. Comp Biochem Physiol 94A: 643-646
10. SCHEID P, MEYER M (1978) tehnica de amestecare pentru studiul echilibrului oxigen-hemoglobină: o evaluare critică. J Appl Physiol 45: 818-822
11. SNYDER GK, Black CP, BIRCHARD GF (1982) dezvoltarea și metabolismul în timpul hipoxiei la embrionii de mare altitudine Anser indicus față de nivelul mării branta canadensis gâște. Physiol Zool 55:113-123
12. VELLARD J (1959) Estudios sobre batracios andinos V: el g unixlnero Bufo. Mem Hist Nat Javier Prado N 8
13. WEBER RE (1992) strategii moleculare în adaptările funcției hemoglobinei vertebrate în: WOOD SC, WEBER re, HARGENS AR, MILLARD RW (eds) Physiol adaptări la vertebrate, New York: Marcel Dekker
14. WINSLOW RM, MORRISSEY JM, BERGER RL, SMITH PD, GIBSON CC (1978) variabilitatea afinității oxigenului din sângele normal: o metodă automată de măsurare. J Appl Physiol: Respirator Environ Exercițiu Physiol 45(2): 289-297