Hämoglobinaffinität für Sauerstoff in drei Unterarten von Kröten (Bufo sp.) leben in verschiedenen Höhen
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratorio de Transporte de Oxígeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
ABSTRACT
Die Blutsauerstoffaffinität und die Eigenschaften roter Blutkörperchen wurden in drei Unterarten der Gattung Bufo gemessen: Bufo spinulosus limensis, gesammelt auf Meereshöhe und bei einer durchschnittlichen Tagestemperatur von 20ºC; Bufo spinulosus trifolium, ab 3100 m, durchschnittliche Tagestemperatur von 15ºC; und Bufo spinulosus flavolineatus, ab 4100 m, durchschnittliche Tagestemperatur von 10ºC. Die Elektrophorese des Hämoglobins zeigte in jeder der drei Unterarten die gleiche Komponente. Bei 20ºC zeigten die Blutsauerstoffaffinitäten (P50) kleine Unterschiede zwischen Bufo spinulosus limensis und Bufo spinulosus trifolium, während der Wert für Bufo spinulosus flavolineatus deutlich niedriger war. Bei 10ºC, der Umgebungstemperatur von Bufo spinulosus flavolineatus, war die P50 im Vergleich zu den beiden anderen Unterarten bei ihren entsprechenden Umgebungstemperaturen extrem niedrig.
SCHLÜSSELWÖRTER: Anpassungen, Höhe, Amphibien, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, Hämoglobinaffinität, Hämatokrit, Sauerstoffbindung, Kröten
EINFÜHRUNG
In Peru nimmt die Gattung Bufo einen Höhengradienten ein, der vom Meeresspiegel bis über 4000 m reicht. Die Art Bufo spinulosus hat drei Unterarten, deren Nischen sich in niedrigen, mittleren und hohen Höhen befinden. Diese Unterarten sind Bufo spinulosus limensis (niedrige Höhe), Bufo spinulosus trifolium (mittlere Höhe) und Bufo spinulosus flavolineatus (hohe Höhe) (12). Eine der am intensivsten untersuchten Umweltanpassungen des Atmungssystems bei Wirbeltieren ist die Hypoxie, die in großer Höhe, in der Embryonalentwicklung (z. B. in utero) und in aquatischen, insbesondere Süßwasserumgebungen unterschiedlich auftritt. Diese Anpassungen beinhalten häufig Änderungen in den Eigenschaften der roten Blutkörperchen, in der Sauerstofftragfähigkeit oder in der Sauerstoffaffinität des Hämoglobins. Intraspezifische Anpassungen, die bei demselben Tier unter verschiedenen Bedingungen auftreten, beinhalten im Allgemeinen Änderungen allosterischer Faktoren (d. H. Der Bedingungen, unter denen das Hämoglobin in den roten Blutkörperchen funktioniert), während interspezifische Anpassungen, die beim Vergleich verschiedener Arten offensichtlich sind, auf Änderungen der Eigenschaften der Hämoglobinmoleküle zurückzuführen sind.
Die meisten Studien zu hypoxischen Anpassungen der Erythrozyten- und Hämoglobineigenschaften beziehen sich auf Fische und Säugetiere, und über untere ektotherme Wirbeltiere ist nur sehr wenig bekannt. Eine frühere Studie zeigte, dass der Titicacasee-Frosch Telmatobius culeus (2), der auf 3800 m lebte. hatte eine höhere O2-Affinität im Blut und kleinere Blutzellen als Frösche auf Meereshöhe. Diese Studie beschreibt die Anpassungen in Bufo-Unterarten.
MATERIAL UND METHODEN
Anurane der Unterart Bufo spinulosus limensis wurden in den Küstenebenen etwa 400 km von unserem Labor in Lima entfernt (Meeresspiegel, durchschnittliche Tagestemperatur 20ºC) gesammelt. Bufo spinulosus trifolium wurden in den zentralperuanischen Anden (etwa 3100 m, durchschnittliche Tagestemperatur 15ºC) und Bufo spinulosus flavolineatus auch in den Zentralanden (bei 4100 m, durchschnittliche Tagestemperatur 10ºC) gesammelt. Die Tiere wurden innerhalb weniger Stunden in unser Labor gebracht. Blut wurde in heparinisierten Spritzen aus den Herzen zuvor markierter Tiere entnommen. Etwa 3 ml Blut konnten von Bufo spinulosus limensis und 1 bis 1,5 ml von den anderen Unterarten gewonnen werden. Zur Durchführung der Bestimmungen wurde Blut von zwei bis drei Tieren gepoolt. Die Anzahl der roten Blutkörperchen, die Hämoglobinkonzentration und die Hämatokritwerte wurden mit herkömmlichen Techniken gemessen.
Die Elektrophorese des Hämoglobins wurde auf Celluloseacetatstreifen in einem für die Hämoglobinelektrophorese spezifischen Puffer durchgeführt, und die Banden wurden mit Ponceau S angefärbt und in einem Densitometer gemäß der Bedienungsanleitung von Helena Laboratories (USA) abgelesen.
Die Blutsauerstoffaffinität (P50) wurde mit der Mischtechnik (1,10) bei 10ºC, 15ºC und 20ºC gemessen. Die Blutäquilibrierung wurde in einem bei diesen Temperaturen gehaltenen Tonometer unter Verwendung von Gasgemischen mit 4,5% CO2 und variablen O2- und N2-Konzentrationen durchgeführt. Die O2-Sättigung im Blut variierte zwischen 30 und 80%. Das pH-Meter wurde mit hochpräzisen Phosphatpuffern kalibriert.
Die pH-Werte bei den Gleichgewichtstemperaturen (eq) wurden aus denen bei Messtemperaturen (meas) nach der Gleichung von Rosenthal (8) berechnet:
pHeq = pH meas + 0,0147 (Teq _ Tmeas)
Der Bohr-Faktor wurde durch Änderung des Blut-pH-Wertes wie folgt erhalten. Aus Blutaliquots hergestelltes Plasma wurde entweder mit Milchsäure angesäuert oder mit Natriumhydroxid alkalisiert und mit den entsprechenden roten Blutkörperchen rekonstituiert. Die Blutproben von Bufo spinulosus limensis und Bufo spinulosus trifolium wurden bei 20ºC und 15ºC und das Blut von Bufo spinulosus flavolineatus bei 20ºC und 10ºC und bei unterschiedlichen pH-Werten äquilibriert, um den Bohr-Faktor für jede Temperatur zu berechnen (14). Dieser Faktor ermöglichte die Berechnung des Standard-Blut-pH-Wertes bei den drei Temperaturen. Zur Berechnung des Hügelkoeffizienten (n) wurde eine Methode sukzessiver Approximationen verwendet (10). Ein Wert aus der Bohr-Gleichung für jede Unterart wurde aus Daten in separaten Experimenten berechnet.
Die van’t Hoff-Gleichung wurde verwendet, um die Gesamtwärme der Oxygenierung DH‘ aus den P50-Werten zu berechnen. Für Bufo spinulosus limensis wurden Werte bei 20ºC und 15ºC mit 20ºC als Umgebungstemperatur verwendet. Für Bufo spinulosus trifolium wurden die Werte bei 15ºC und 20ºC mit 15ºC als Umgebungstemperatur verwendet. Für Bufo spinulosus flavolineatus wurden die Werte bei 10ºC und 20ºC mit 10ºC als Umgebungstemperatur verwendet. Die statistische Signifikanz wurde mittels Student’s t Test mit Software Systat 6.0 für Windows ermittelt.
ERGEBNISSE
Die Tabellen I und II fassen die hämatologischen Daten zusammen. Es gibt keinen statistischen Unterschied zwischen den Werten von Bufo spinulosus limensis und Bufo spinulosus trifolium. Die Werte von Hämatokrit, Hämoglobin und Erythrozytenmenge in Bufo spinulosus flavolineatus sind viel niedriger.
Die Elektrophorese-Experimente zeigten die gleichen Migrationsabstände in den Hämoglobinen jeder der drei Unterarten und das Vorhandensein von zwei Banden in einigen der Läufe (Abb. 4). Es wurden keine weiteren Studien durchgeführt, um die Hämoglobineigenschaften zu definieren.
Tabelle II zeigt die funktionellen Eigenschaften des Hämoglobins im Blut und zeigt kleine Unterschiede im P50 zwischen Bufo spinulosus limensis und Bufo spinulosus trifolium, während der Wert für Bufo spinulosus flavolineatus niedriger ist. Die Werte bei der Umgebungstemperatur, bei der die Tiere gesammelt wurden, unterschieden sich nicht signifikant zwischen Bufo spinulosus limensis und Bufo spinulosus trifolium. Bei Bufo spinulosus flavolineatus ist der P50-Wert bei 10ºC sehr niedrig. Abbildung 1 zeigt ein Diagramm von log P50 vs. pH. Abbildung 2 zeigt Hämoglobin-Sauerstoff-Dissoziationskurven, die mit den Werten von P50 und dem Hill-Koeffizienten bei 20º C konstruiert wurden. Die Kurven für Bufo spinulosus limensis und Bufo spinulosus trifolium liegen sehr nahe beieinander, während die für den Bufo spinulosus flavolineatus nach links verschoben ist. Abbildung 3 ist ein Diagramm des Blut-O2-Gehalts im Vergleich zu Blut-PO2 bei der Umgebungstemperatur jeder Unterart. Dies zeigt den niedrigen O2-Gehalt und sehr niedrigen P50 von Bufo spinulosus flavolineatus und eine moderate Verschiebung nach links von Bufo spinulosus trifolium im Vergleich zu Bufo spinulosus limensis ohne Verringerung des O2-Gehalts im Blut in Bufo spinulosus limensis und Bufo spinulosus trifolium.
Abb. 1: Bohr-Effekt bei drei Unterarten von Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus zeigt den größten Bohr-Faktor.
Abb. 2: Blutdissoziationskurve für die drei Unterarten bei pH 7,84 und 20º C. Die Krümmung des Bufo spinulosus flavolineatus ist nach links verschoben.
Abb. 3: Hämoglobin O2 Gehalt vs Sauerstoffpartialdruck für jede subspeceis bei der jeweiligen Umgebungstemperatur. Bufo Spinulosus limensis (20º C), Bufo spinulosus trifolium (15º C)Bufo spinulosus flavolineatus (10º C). Der Hämoglobingehalt von Bufo spinulosus flavolineatus ist niedriger als bei den beiden anderen Unterarten und der P50 ist sehr niedrig.
Abb. 4: Elektrophorese der drei Unterarten von Bufo Spinulosus. Das Experiment zeigt die gleichen Migrationsabstände in den Hämoglobinen jeder der drei Unterarten und das Vorhandensein von zwei Banden in einigen der Läufe.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Bufo spinulosus flavolineatus, dessen natürlicher Lebensraum nahe 4000 m liegt und dessen Umgebungstemperatur durchschnittlich 10ºC beträgt, bei 20ºC einen niedrigen Hämoglobingehalt und eine hohe Hämoglobinaffinität aufweist im Vergleich zu Bufo spinulosus trifolium, dessen durchschnittliche Umgebungshöhe nahe 3000 m liegt und dessen Umgebungstemperatur durchschnittlich 15ºC beträgt. Bufo spinulosus limensis (Meeresspiegel) und Bufo spinulosus trifolium hatten fast identische Kurven. Wenn die Kurven bei den Umgebungstemperaturen erhalten wurden, zeigte der Bufo spinulosus flavolineatus im Vergleich zu den beiden anderen Unterarten einen sehr niedrigen O2-Gehalt und eine hohe Hämoglobinaffinität. Bei Bufo spinulosus flavolineatus weist der hohe DH-Faktor auf eine hohe Empfindlichkeit der Hämoglobinaffinität gegenüber Änderungen der Umgebungstemperatur hin, und der hohe Bohr-Faktor weist auch auf eine hohe Empfindlichkeit der Hämoglobinaffinität gegenüber Änderungen des Blut-pH-Werts hin.
DISKUSSION
Die Gattung Bufo ist in den Andenländern weit verbreitet. Bufo spinulosus hat drei Unterarten, deren Nischen sich in den unteren Andenhängen, den Zwischentälern (3000 m) und den höchsten Ebenen (über 4000 m) befinden. Die Unterart Bufo spinulosus trifolium in mittlerer Höhe und die Unterart Bufo spinulosus limensis in Meereshöhe unterscheiden sich nicht in ihren hämatologischen Werten. Der Bufo spinulosus flavolineatus in großer Höhe hat eine viel niedrigere Hämoglobinkonzentration, aber die Eigenschaften der roten Blutkörperchen ähneln denen der beiden anderen Unterarten. Die Erythrozyten scheinen kleiner zu sein als die der beiden anderen Unterarten, im Gegensatz zu den Ergebnissen von Ruiz (9), die das Gegenteil anzeigten. Es ist bekannt, dass die Gattung Bufo eine höhere Hämoglobinkonzentration aufweist als andere Amphibien. Hutchinson und Szarki (3) führen dies auf die hohe Vaskularisierung und terrestrische Gewohnheit zurück. Bufo spinulosus flavolineatus hat jedoch eine sehr niedrige Hämoglobinkonzentration.
In den drei Gruppen zeigt die hämoglobinelektrophoretische Studie Personen, deren elektrophoretisches Muster zwei klar getrennte Hämoglobinbanden aufweist. Es gibt keinen Unterschied in der Hämoglobinaffinität zwischen Bufo spinulosus trifolium und Bufo spinulosus limensis bei 20ºC, während die des Bufo spinulosus flavolineatus höher ist. Bei der Untersuchung der Affinitäten bei den Umgebungstemperaturen, in denen die Tiere leben, wies Bufo spinulosus trifolium Sauerstoffdissoziationskurven auf, die sich mäßig nach links von Bufo spinulosus limensis verschoben, und Bufo spinulosus flavolineatus zeigte eine sehr deutliche Verschiebung, was auf eine sehr hohe Hämoglobinaffinität hinweist.
Einheimische Säugetiere und Vögel in großer Höhe neigen dazu, hohe Blutsauerstoffaffinitäten zu haben und in großer Höhe keine Polyzythämie zu zeigen (5). Es wäre interessant zu beobachten, ob diese Reaktionen auf Umgebungshypoxie und Kälte bei ektothermen Tieren vorhanden sind. Theoretisch sollten kalte Bedingungen dazu beitragen, die Toleranz gegenüber großer Höhe zu erhöhen, da dadurch die Stoffwechselrate verringert wird. Im Fall von Bufo spinulosus flavolineatus,dessen Tagestemperatur unter Felsen auf 4100 m etwa 10ºC und nachts etwa 6ºC oder weniger in den Teichen beträgt, in denen sie halb eingetaucht ruhen, weist die hohe Affinität trotz einer möglichen Verringerung der Stoffwechselrate auf einen Selektionsdruck in Richtung Hypoxie hin. Packard und Stiverson (7) fanden keinen Zusammenhang zwischen Höhe und Hämoglobinkonzentration im Chorfrosch (Pseudacris triseriata), aber der Höhenbereich in ihrer Studie (1500 m und 3000 m) war klein.
Die Hämoglobinaffinität ist eine genetische Markierung, die offenbar durch die hypoxische Umgebung bei Wirbeltieren ausgewählt wird. Bei Säugetieren und Vögeln ist die Affinität eine eher feste Eigenschaft, die bei Hypoxie nicht zunimmt und bei Normoxie nicht verschwindet (6). Bei Fischen hingegen steigt der Blutsauerstoff unter Hypoxie deutlich an (13).
Aus vergleichender Sicht gibt es einige Ähnlichkeiten zwischen Ektothermen und Endothermen. Es wurde festgestellt, dass bei Unterarten von Mäusen, die einen Höhengradienten einnehmen, eine gewisse Korrelation zwischen Hämoglobinaffinität und Höhe besteht (11). Es wurde auch gezeigt, dass innerhalb derselben Säugetierart, die entlang eines vertikalen Gradienten in den Anden lebt, Individuen, die im höchsten Bereich leben, Hämoglobine mit höherer Affinität aufweisen als Individuen, die im niedrigsten Bereich leben. Diese Unterschiede waren beim Andenfuchs größer, wo zwei getrennte Arten die beiden Extreme des Höhenbereichs besetzen (4).
Diese Arbeit verstärkt das Konzept, dass Polyzythämie nicht als adaptiver Parameter für die hypoxische Umgebung ausgewählt wird. Im Gegenteil, hochaffines Hämoglobin scheint bei einer Vielzahl von Tieren, die in großer Höhe leben, stark selektiert zu sein.
DANKSAGUNG
Wir danken Dr. Roy E. Weber für seine Hilfe bei der Klärung unseres Denkens zu diesem Thema und für die Überprüfung des Manuskripts.
Korrespondierender Autor: Hrvoj Ostojic P. – Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Telefon: (56-57) 420599, Telefax: (56-57) 427683, E-Mail: [email protected]
Empfangen: August 13, 1999. Angenommen in überarbeiteter Form: 6. Mai 2000
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