Hemoglobinaffinitet för syre i tre underarter av paddor (Bufo sp.) att leva på olika höjder
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratorio De Transporte de Oxusporiggeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, per kg
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
abstract
blodets SYREAFFINITET och röda blodkroppsegenskaper mättes i tre underarter av släktet Bufo: bufo spinulosus limensis, samlade vid havsnivå och vid en genomsnittlig dagstemperatur på 20 oC; Bufo spinulosus trifolium, från 3100 m, Genomsnittlig dagstemperatur på 15 ACC; och Bufo spinulosus flavolineatus, från 4100 m, Genomsnittlig dagstemperatur på 10 ACC. Elektrofores av hemoglobinet visade samma komponent i var och en av de tre underarterna. Vid 20 OCCC visade blodsyreaffiniteterna (P50) små skillnader mellan Bufo spinulosus limensis och Bufo spinulosus trifolium, medan värdet för Bufo spinulosus flavolineatus var markant lägre. Vid 10 UCC, omgivningstemperaturen för Bufo spinulosus flavolineatus, var P50 extremt låg jämfört med de andra två underarterna vid motsvarande omgivningstemperaturer.
nyckelord: anpassningar, höjd, amfibier, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, hemoglobinaffinitet, hematokriter, syrebindning, paddor
introduktion
i Peru upptar släktet Bufo en höjdgradient som sträcker sig från havsnivå till över 4000 m. Arten Bufo spinulosus har tre underarter vars nischer ligger på låga, mellanliggande och höga höjder. Dessa underarter är Bufo spinulosus limensis (låg höjd), Bufo spinulosus trifolium (mellanliggande höjd) och Bufo spinulosus flavolineatus (hög höjd) (12). En av de mest intensivt studerade miljöanpassningarna av andningssystemet hos ryggradsdjur är hypoxi, som uppträder olika i hög höjd, i embryonal utveckling (t.ex. i utero) och i vattenlevande, särskilt sötvattenmiljöer. Dessa anpassningar involverar vanligtvis förändringar i egenskaperna hos de röda cellerna, i syrebärande kapacitet eller i syreaffiniteten hos hemoglobinet. Intraspecifika anpassningar, som förekommer i samma djur under olika förhållanden, involverar i allmänhet förändringar i allosteriska faktorer (dvs de förhållanden under vilka hemoglobinet fungerar inuti de röda cellerna), medan interspecifika anpassningar, som är uppenbara vid jämförelse av olika arter, kan hänföras till förändringar i egenskaperna hos hemoglobinmolekylerna.
de flesta studier på hypoxiska anpassningar i röda blodkroppar och hemoglobinegenskaper avser fisk och däggdjur, och mycket lite är känt om lägre ektoterma ryggradsdjur. En tidigare studie visade att Titicacasjön groda Telmatobius culeus (2) lever på 3800 m. hade högre blod O2 affinitet och mindre blodkroppar än havsnivån grodor. Denna studie beskriver anpassningarna i Bufo-underarter.
MATERIAL och metoder
Anuraner av underarten Bufo spinulosus limensis samlades in från kustslätterna på cirka 400 km från vårt laboratorium i Lima (havsnivå, Genomsnittlig dagstemperatur 20 OCCBC). Bufo spinulosus trifolium samlades i de centrala peruanska Anderna (ca 3100 m, Genomsnittlig dagstemperatur 15 OC C) och Bufo spinulosus flavolineatus också i centrala Anderna (vid 4100 m, Genomsnittlig dagstemperatur 10 OC C). Djuren fördes till vårt laboratorium inom några timmar. Blod drogs i hepariniserade sprutor från hjärtan hos tidigare pithed djur. Cirka 3 ml blod kunde erhållas från Bufo spinulosus limensis och 1 till 1, 5 ml från de andra underarterna. Blod från två till tre djur samlades för att utföra bestämningarna. Röda blodkroppar, hemoglobinkoncentration och hematokriter mättes med konventionella tekniker.
elektrofores av hemoglobinet kördes på cellulosaacetatremsor i en buffert som är specifik för hemoglobinelektrofores, och banden färgades med Ponceau S och lästes i en densitometer enligt Helena Laboratories (USA) bruksanvisning.
blod-syrgasaffiniteten (P50) mättes med blandningstekniken (1,10) vid 10 ACC, 15 ACC och 20 ACC. Blodjämvikten utfördes i en tonometer som hölls vid dessa temperaturer med användning av gasblandningar innehållande 4,5% CO2 och variabla O2-och N2-koncentrationer. Blod O2 mättnad varierade mellan 30 och 80%. PH-mätaren kalibrerades med hjälp av fosfatbuffertar med hög precision.
pH-värdena vid jämviktstemperaturerna (eq) beräknades från de vid mättemperaturer (meas) med hjälp av ekvationen som ges av Rosenthal (8):
pHeq = pH meas + 0,0147 (Teq _ Tmeas)
Bohr-faktorn erhölls genom att ändra blodets pH enligt följande. Plasma framställt från alikvoter i blod surgjordes antingen med mjölksyra eller alkaliserades med natriumhydroxid och rekonstituerades med motsvarande röda blodkroppar. Blodproverna från Bufo spinulosus limensis och Bufo spinulosus trifolium jämviktades vid 20 och 15 och blodet från Bufo spinulosus flavolineatus vid 20 och 10 och vid olika pH-värden för att beräkna Bohr-faktorn för varje temperatur (14). Denna faktor möjliggjorde beräkningen av standardblodets pH vid de tre temperaturerna. För att beräkna Kullens koefficient (n) användes en metod för successiva approximationer (10). Ett värde från Bohr-ekvationen för varje underart beräknades från data i separata experiment.
van’ t Hoff-ekvationen användes för att beräkna den totala värmen för syresättning DH ’ från P50-värdena. För Bufo spinulosus användes limensis-värden vid 20 och 15 och 20 som Omgivningstemperatur. För Bufo spinulosus trifolium användes värdena vid 15 och 20 och 15 som Omgivningstemperatur. För Bufo spinulosus flavolineatus användes värdena vid 10 och 20 och 10 som Omgivningstemperatur. Den statistiska signifikansen bestämdes av studentens t-test med programvara Systat 6.0 för Windows.
resultat
tabellerna i och II sammanfattar hematologiska data. Det finns ingen statistisk skillnad mellan värdena för Bufo spinulosus limensis och Bufo spinulosus trifolium. Värdena för hematokrit, hemoglobin och mängden RBC i Bufo spinulosus flavolineatus är mycket lägre.
elektroforesexperimenten visade samma migrationsavstånd i hemoglobinerna hos var och en av de tre underarterna och närvaron av två band i några av körningarna (Fig. 4). Inga ytterligare studier utfördes för att definiera hemoglobinegenskaperna.
tabell II visar hemoglobinets funktionella egenskaper i blod, vilket avslöjar små skillnader i P50 mellan Bufo spinulosus limensis och Bufo spinulosus trifolium, medan värdet för Bufo spinulosus flavolineatus är lägre. Värdena vid omgivningstemperaturen där djuren samlades skilde sig inte signifikant mellan Bufo spinulosus limensis och Bufo spinulosus trifolium. När det gäller Bufo spinulosus flavolineatus är P50-värdet mycket lågt vid 10 OCCC. Figur 1 visar en plot av log P50 vs. pH. Figur 2 visar hemoglobin syre dissociationskurvor konstruerade med värdena för P50 och Hill koefficient vid 20 C. kurvorna för Bufo spinulosus limensis och Bufo spinulosus trifolium är mycket nära varandra, medan det för Bufo spinulosus flavolineatus flyttas till vänster. Figur 3 är en plot av blod O2-innehåll vs. blod PO2 vid omgivningstemperaturen för varje underart. Detta visar det låga O2-innehållet och mycket låga P50 för Bufo spinulosus flavolineatus och en måttlig förskjutning till vänster om Bufo spinulosus trifolium jämfört med Bufo spinulosus limensis utan minskning av blodets O2-innehåll i Bufo spinulosus limensis och Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1: Bohr effekt i tre underarter av Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus visar den största Bohr-faktorn.
Fig. 2: Blooddissociations-kurva för de tre underarterna vid pH av 7,84 och 20 kcal C. Kurvan för Bufo spinulosus flavolineatus förskjuts till vänster.
Fig. 3: Hemoglobin O2-innehåll vs partiellt syretryck för varje subspeceis vid respektive ekologiska temperatur. Bufo Spinulosus limensis (20 kg C), Bufo spinulosus trifolium (15 kg C) Bufo spinulosus flavolineatus (10 kg C). Hemoglobinhalten i Bufo spinulosus flavolineatus är lägre än i de två andra underarterna och P50 är mycket låg.
Fig. 4: elektrofores av de tre underarterna av Bufo Spinulosus. Experimentet visar samma migrationsavstånd i hemoglobinerna hos var och en av de tre underarterna och närvaron av två band i några av körningarna.
dessa resultat visar att Bufo spinulosus flavolineatus, vars naturliga livsmiljö ligger nära 4000 m och vars Omgivningstemperatur är i genomsnitt 10 kg, har ett lågt hemoglobininnehåll och en hög hemoglobinaffinitet jämfört med Bufo spinulosus trifolium, vars genomsnittliga omgivande höjd är nära 3000 m och vars omgivande medeltemperatur är 15 kg. Bufo spinulosus limensis (havsnivå) och Bufo spinulosus trifolium hade nästan identiska kurvor. Om kurvorna erhölls vid omgivningstemperaturerna visade Bufo spinulosus flavolineatus ett mycket lågt O2-innehåll och hög hemoglobinaffinitet jämfört med de andra två underarterna. I Bufo spinulosus flavolineatus indikerar den höga DH’ en hög känslighet för hemoglobinaffiniteten för förändringar i omgivande temperatur, och den höga Bohr-faktorn indikerar också en hög känslighet för hemoglobinaffinitet för förändringar i blodets pH.
diskussion
släktet Bufo är utbrett i Andinska länder. Bufo spinulosus har tre underarter vars nischer ligger i de nedre Andinska sluttningarna, de mellanliggande Dalarna (3000 m) och de högsta slätterna (över 4000 m). De mellanliggande höjdunderarterna Bufo spinulosus trifolium och havsnivåunderarterna Bufo spinulosus limensis skiljer sig inte åt i deras hematologiska värden. Den höga höjden Bufo spinulosus flavolineatus har en mycket lägre hemoglobinkoncentration, men de röda cellernas egenskaper liknar de andra två underarterna. RBC: erna verkar vara mindre än de i de andra två underarterna, till skillnad från Ruizs (9) fynd, vilket indikerade motsatsen. Det är känt att släktet Bufo har en högre hemoglobinkoncentration än andra amfibier. Hutchinson och Szarki (3) tillskriver detta den höga vaskulariseringen och den jordiska vanan. Bufo spinulosus flavolineatus har dock mycket låg hemoglobinkoncentration.
i de tre grupperna visar hemoglobinelektroforetisk studie individer vars elektroforetiska mönster presenterar två tydligt separata hemoglobinband. Det finns ingen skillnad i hemoglobinaffiniteten mellan Bufo spinulosus trifolium och Bufo spinulosus limensis vid 20 OCC, medan det i Bufo spinulosus flavolineatus är högre. När affiniteterna studerades vid de omgivande temperaturerna där djuren lever, hade Bufo spinulosus trifolium syredissociationskurvor som skiftade måttligt till vänster om Bufo spinulosus limensis, och Bufo spinulosus flavolineatus visade ett mycket markant skift, vilket indikerar en mycket hög hemoglobinaffinitet.
infödda däggdjur och fåglar i hög höjd tenderar att ha höga syreaffiniteter i blodet och inte visa polycytemi vid hög höjd (5). Det skulle vara intressant att observera om dessa svar på omgivande hypoxi och kalla förhållanden finns i ektotermiska djur. I teorin bör kalla förhållanden bidra till att öka toleransen mot hög höjd eftersom det minskar ämnesomsättningen. När det gäller Bufo spinulosus flavolineatus, vars dagstemperatur under stenar vid 4100 m är ca 10 OCCCC och ca 6 OCCCC eller mindre på natten i dammarna där de vilar halvt nedsänkt, indikerar den höga affiniteten selektionstryck mot hypoxi trots en möjlig minskning av metabolisk hastighet. Packard och Stiverson (7) hittade inte ett samband mellan höjd och hemoglobinkoncentration i körgrodan (Pseudacris triseriata), men höjdintervallet i deras studie (1500 m och 3000 m) var liten.
hemoglobinaffiniteten är ett genetiskt märke som tydligen väljs av den hypoxiska miljön hos ryggradsdjur. Hos däggdjur och fåglar är affiniteten en ganska fast egenskap som inte ökar i hypoxi och försvinner inte i normoxi (6). I fisk ökar å andra sidan syre i blodet markant under hypoxi (13).
ur en jämförande synvinkel finns det vissa likheter mellan ektotermer och endotermer. Det har visat sig att det finns en viss korrelation mellan hemoglobinaffinitet och höjd i underarter av möss som upptar en höjdgradient (11). Det har också visats att inom samma däggdjursarter som lever längs en vertikal gradient i Anderna har individer som lever i det högsta intervallet hemoglobiner med högre affinitet än individer som lever i det lägsta intervallet. Dessa skillnader var större när det gäller Andesräven, där två separata arter upptar de två ytterligheterna i höjdområdet (4).
detta arbete förstärker konceptet att polycytemi inte väljs som en adaptiv parameter till den hypoxiska miljön. Tvärtom verkar högaffinitetshemoglobin vara starkt utvalt i en mängd olika djur som lever i hög höjd.
bekräftelser
vi tackar Dr.Roy E. Weber för hans hjälp med att klargöra vårt tänkande om detta ämne och för att granska manuskriptet.
Motsvarande Författare: Hrvoj Ostojic P. – Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Telefon: (56-57) 420599, Fax: (56-57) 427683, e-post: [email protected]
mottagen: 13 augusti 1999. Godkänd i reviderad form: 6 maj 2000
bibliografi
1. EDWARDS MJ, MARTIN RJ (1966). Blandningsteknik för syre-hemoglobinjämvikt och Bohr-effekt. J Appl Physiol 21:1898-1902
2. HUTCHINSON VH, HAINES HB, ENGEBRETSON G (1976) vattenlevande liv på hög höjd: Andningsanpassningar i Titicacasjön groda, Telmatobius culeus. Respir Physiol 2:115-119.
3. HUTCHINSON VH, SZARSKI H (1965) antal erytrocyter i vissa amfibier och reptiler. Copeia: 373-375
4. LEON-VELARDE F, de MUIZON C, PALACIOS JA, CLARK D, MONGE-C C (1996) Hemoglobinaffinitet och struktur i höghöjd och havsnivå köttätare från Peru. Comp Biochem Physiol 113A:407-411
5. MCCUTCHEON FH HALL FG (1937) Hemoglobin i amfibien. J Cell & Comp Physiol 9:191-197
6. MONGE C, LEON-VELARDE F (1991) fysiologisk anpassning till hög höjd: syretransport hos däggdjur och fåglar. Physiol Rev 71: 1135-1172
7. PACKARD G C STIVERSON RK (1976) blodhemoglobinkoncentration i kör groda (Pseudacris triseriata): förhållande till kroppsstorlek och höjd. Am Midl Nat 96: 482-487
8. ROSENTHAL TB (1948) effekten av temperatur på pH i blod och plasma in vitro. J Biol Chem 173:25-30
9. RUIZ G, ROSENMANN M, VELOSO A. (1989) Höjdfördelning och blodvärden i padden, Bufo spinulosus Wiegmann. Comp Biochem Physiol 94A: 643-646
10. SCHEID P, MEYER M (1978) blandningsteknik för studier av syre-hemoglobinjämvikt: en kritisk utvärdering. J Appl Physiol 45: 818-822
11. SNYDER GK, svart CP, BIRCHARD GF (1982) utveckling och metabolism under hypoxi i embryon av hög höjd Anser indicus kontra havsnivå Branta canadensis gäss. Physiol Zool 55:113-123
12. VELLARD J (1959) Estudios sobre batracios andinos V: el G. Mem Hist Nat Javier Prado N 8
13. WEBER RE (1992) molekylära strategier vid anpassningar av ryggradshemoglobinfunktion i: WOOD SC, WEBER RE, HARGENS AR, MILLARD RW (eds) Physiol anpassningar hos ryggradsdjur, New York: Marcel Dekker
14. WINSLOW RM, MORRISSEY JM, BERGER RL, SMITH PD, GIBSON CC (1978) variabilitet av syreaffinitet hos normalt blod: en automatiserad mätmetod. J Appl Physiol: Andningsskydd Miljö Övning Physiol 45(2): 289-297