Protein kinazele sunt cea mai mare superfamilie enzimatică implicată în transducția semnalului celular și reprezintă ținte terapeutice pentru o serie de boli. Au existat eforturi intense din partea multor laboratoare pentru a înțelege mecanismele lor catalitice, a descoperi inhibitori și a discerne funcțiile lor celulare. În această revizuire, vom descrie două abordări dezvoltate pentru a analiza protein kinazele: inhibarea analogului bisubstrat și utilizarea analogică a fosfonatului. Ambele metode au fost utilizate în combinație cu metoda de semisinteză a proteinelor exprimată ligarea proteinelor pentru a avansa înțelegerea interacțiunilor kinază-substrat și elucidarea funcțională a fosforilării. Lucrările anterioare privind natura mecanismului protein kinazei sugerează că urmează o stare de tranziție disociativă. Un analog bisubstrat a fost proiectat împotriva kinazei receptorului de insulină pentru a imita geometria unei distanțe de coordonate de reacție a stării de tranziție disociativă. Acest compus bisubstrat s-a dovedit a fi un inhibitor puternic împotriva kinazei receptorului de insulină și a ocupat atât situsurile de legare a peptidelor, cât și a nucleotidelor. Compușii bisubstrați cu potențial de legare a hidrogenului modificat, precum și distanțiere variate între adenină și peptidă demonstrează importanța caracteristicilor originale de proiectare. Am arătat, de asemenea, că analogii bisubstrați înrudiți pot fi utilizați pentru a bloca puternic Serina/treonin kinazele, inclusiv protein kinaza A. Deoarece multe protein kinaze recunosc substraturile proteice pliate pentru fosforilarea eficientă, a fost avantajos să se încorporeze conjugații peptid-ATP în structurile proteice. Folosind ligaturarea proteică exprimată, a fost produs un conjugat Src-ATP și s-a dovedit a fi un ligand cu afinitate ridicată pentru tirozin kinaza Csk. Imitațiile nonhidrolizabile ale fosfoserului / fosfotirului pot fi utile în examinarea funcționalității evenimentelor de fosforilare. Folosind ligaturarea exprimată a proteinelor, am folosit fosfonometilen fenilalanină și fosfonometilen alanină pentru a sonda fosforilarea Tyr și, respectiv, Ser. Aceste instrumente au permis o analiză a SH2-fosfatazelor (SHP1 și SHP2), dezvăluind o nouă stimulare intramoleculară a activității catalitice mediată de evenimentele de fosforilare corespunzătoare. De asemenea, au fost utilizate pentru a caracteriza reglarea celulară a enzimei ritmului melatoninei prin fosforilare.