proteinkinaser er den største superfamilie involveret i cellesignaltransduktion og repræsenterer terapeutiske mål for en række sygdomme. Der har været en intensiv indsats fra mange laboratorier for at forstå deres katalytiske mekanismer, opdage hæmmere og skelne deres cellulære funktioner. I denne gennemgang vil vi beskrive to tilgange udviklet til analyse af proteinkinaser: bisubstrat analog hæmning og phosphonat analog udnyttelse. Begge disse metoder er blevet anvendt i kombination med proteinsemisyntesemetoden udtrykt proteinligering for at fremme vores forståelse af kinase-substratinteraktioner og funktionel belysning af phosphorylering. Tidligere arbejde med arten af proteinkinasemekanismen antyder, at den følger en dissociativ overgangstilstand. En bisubstrat-analog blev designet mod insulinreceptorkinasen for at efterligne geometrien af en dissociativ overgangstilstandsreaktionskoordinatafstand. Denne bisubstrat forbindelse viste sig at være en potent hæmmer mod insulinreceptorkinasen og besatte både peptid-og nukleotidbindingssteder. Bisubstrat-forbindelser med ændret hydrogenbindingspotentiale såvel som varierende afstandsstykker mellem adeninet og peptidet demonstrerer vigtigheden af de originale designfunktioner. Vi har også vist, at relaterede bisubstrat-analoger kan bruges til kraftigt at blokere serin / threoninkinaser inklusive proteinkinase A. Da mange proteinkinaser genkender foldede proteinsubstrater til effektiv phosphorylering, var det fordelagtigt at inkorporere peptid-ATP-konjugaterne i proteinstrukturer. Ved anvendelse af udtrykt proteinligering blev der produceret et Src-ATP-konjugat og vist sig at være en ligand med høj affinitet for Csk tyrosinkinase. Ikke-hydrolyserbare efterligninger af phosphoSer / phosphoTyr kan være nyttige til at undersøge funktionaliteten af phosphoryleringshændelser. Ved anvendelse af udtrykt proteinligering har vi anvendt phosphomethylenphenylalanin og phosphomethylenalanin til at undersøge phosphoryleringen af henholdsvis Tyr og Ser. Disse værktøjer har tilladt en analyse af SH2-phosphataserne (SHP1 og SHP2), der afslører en ny intramolekylær stimulering af katalytisk aktivitet medieret af de tilsvarende phosphoryleringshændelser. De er også blevet brugt til at karakterisere den cellulære regulering af melatoninrytmen ved phosphorylering.