proteína cinases são a maior superfamília enzimática envolvida na transdução de sinais celulares e representam alvos terapêuticos para uma série de doenças. Tem havido intensos esforços de muitos laboratórios para entender seus mecanismos catalíticos, descobrir inibidores e discernir suas funções celulares. Nesta revisão, descreveremos duas abordagens desenvolvidas para analisar cinases proteicas: inibição analógica do bisubstrato e utilização analógica de fosfonato. Ambos os métodos têm sido usados em combinação com o método de semisíntese proteica expressa ligação proteica para avançar nossa compreensão das interações com substrato de cinase e elucidação funcional da fosforilação. Trabalhos anteriores sobre a natureza do mecanismo de proteína cinase sugerem que segue um estado de transição dissociativa. Um analógico bisubstrado foi projetado contra o receptor de insulina kinase para imitar a geometria de uma distância dissociativa de Estado de transição de reação coordenada. Este composto bisubstrato provou ser um potente inibidor contra o receptor de insulina quinase e ocupou tanto os locais de ligação peptídica como nucleótidos. Compostos bisubstratos com potencial de ligação de hidrogênio alterado, bem como espaçadores variáveis entre a adenina e o peptídeo demonstram a importância das características de projeto originais. Também temos mostrado que análogos de bisubstrato relacionados podem ser usados para bloquear potentemente a serina / cinases de treonina, incluindo a proteína cinase A. Uma vez que muitas cinases proteicas reconhecem substratos protéicos dobrados para uma fosforilação eficiente, foi vantajoso incorporar os conjugados peptídeo-ATP em estruturas proteicas. Usando ligação proteica expressa, um conjugado Src-ATP foi produzido e mostrou ser um ligante de alta afinidade para a tirosina cinase Csk. Imitações não hidrolisáveis de fosfoser / fosfotyr podem ser úteis para examinar a funcionalidade dos eventos de fosforilação. Utilizando a ligação proteica expressa, empregámos a fenilalanina fosfonometileno e a alanina fosfonometileno para sondar a fosforilação de Tyr e Ser, respectivamente. Estas ferramentas permitiram uma análise das fosfatases SH2 (SHP1 e SHP2), revelando uma nova estimulação intramolecular da actividade catalítica mediada pelos correspondentes eventos de fosforilação. Eles também foram usados para caracterizar a regulação celular da enzima do ritmo da melatonina por fosforilação.