Proteinkinasen sind die größte Enzym-Superfamilie, die an der Zellsignaltransduktion beteiligt ist und therapeutische Ziele für eine Reihe von Krankheiten darstellt. Viele Labore haben sich intensiv bemüht, ihre katalytischen Mechanismen zu verstehen, Inhibitoren zu entdecken und ihre zellulären Funktionen zu erkennen. In diesem Beitrag, Wir werden zwei Ansätze beschreiben, die zur Analyse von Proteinkinasen entwickelt wurden: analoge Bisubstrathemmung und analoge Phosphonatverwertung. Beide Methoden wurden in Kombination mit der Proteinhalbsynthesemethode und der Proteinligatur verwendet, um unser Verständnis der Kinase-Substrat-Wechselwirkungen und der funktionellen Aufklärung der Phosphorylierung zu verbessern. Frühere Arbeiten zur Art des Proteinkinase-Mechanismus legen nahe, dass er einem dissoziativen Übergangszustand folgt. Ein Bisubstratanalogon wurde gegen die Insulinrezeptorkinase entwickelt, um die Geometrie einer dissoziativen Übergangszustandsreaktionskoordinatenentfernung nachzuahmen. Diese Bisubstratverbindung erwies sich als potenter Inhibitor gegen die Insulinrezeptorkinase und besetzte sowohl Peptid- als auch Nukleotidbindungsstellen. Bisubstratverbindungen mit verändertem Wasserstoffbindungspotential sowie variierende Spacer zwischen Adenin und Peptid zeigen die Bedeutung der ursprünglichen Konstruktionsmerkmale. Wir haben auch gezeigt, dass verwandte Bisubstrat-Analoga verwendet werden können, um Serin / Threonin-Kinasen einschließlich Proteinkinase A wirksam zu blockieren. Da viele Proteinkinasen gefaltete Proteinsubstrate für eine effiziente Phosphorylierung erkennen, war es vorteilhaft, die Peptid-ATP-Konjugate in Proteinstrukturen einzubauen. Unter Verwendung der exprimierten Proteinligation wurde ein Src-ATP-Konjugat hergestellt, das sich als hochaffiner Ligand für die Csk-Tyrosinkinase erwies. Nicht hydrolysierbare Nachahmungen von phosphoSer / phosphoTyr können bei der Untersuchung der Funktionalität von Phosphorylierungsereignissen nützlich sein. Unter Verwendung der exprimierten Proteinligation haben wir Phosphonomethylen-Phenylalanin und Phosphonomethylen-Alanin eingesetzt, um die Phosphorylierung von Tyr bzw. Diese Werkzeuge ermöglichten eine Analyse der SH2-Phosphatasen (SHP1 und SHP2) und enthüllten eine neuartige intramolekulare Stimulation der katalytischen Aktivität, die durch die entsprechenden Phosphorylierungsereignisse vermittelt wurde. Sie wurden auch verwendet, um die zelluläre Regulation des Melatonin-Rhythmus-Enzyms durch Phosphorylierung zu charakterisieren.