Onkologie Zprávy

Úvod

rakovina Plic je maligní nádor s highestmorbidity a úmrtnosti po celém světě, a jeho výskyt je na rozšiřováním. Přibližně 80% onemocnění může být přičítánonemalobuněčný karcinom plic (NSCLC) (1). Vzhledem k omezením časnýchdiagnostické techniky a nedostatek časných specifických klinickýchprojevy, 70-80% pacientů je diagnostikováno v pokročilých stádiích (2). Proto je identifikace asafe a účinné léčby NSCLC zásadní.

Nedávné nálezy ukázaly, že výskyt,rozvoj a převod NSCLC jsou nejen ovlivněny bygenetic faktory, ale to, že epigenetické změny je také důležité,včetně malé molekuly nekódující RNA (ncRNA) (3). MikroRNA (miRNA), třída endogenníchmalá ncRNA o délce ~21-25 bází, široce existující ineukaryoty, může identifikovat mRNA specifického cílového genu (4). Více než 50% genů Mirna je mapováno v křehkých místech nebo genomových oblastech souvisejících s NSCLC, což naznačuje, že exprese miRNA může být úzce spojena snsclc. Jak bylo oznámeno, že exprese velkého počtu miRNAs inNSCLC show porucha a nerovnováha miRNAs podporovat theprogression NSCLC buněčného cyklu, anti-apoptotických efekt, enhancedcell invaze a metastáz z nemalobuněčného karcinomu plic(5).

signální dráha PI3K / Akt hraje důležitou roli v přežití buněk zprostředkovaných růstovým faktorem. Předchozí nálezyukázaly, že porucha dráhy PI3K / Akt/mTOR může hrátdůležitou roli při tvorbě NSCLC (6). To také bylo hlásil, že cellproliferation signál generovaný kombinace počet oftransmembrane receptory a ligandy mohou aktivovat signaltransduction z PI3K/Akt/mTOR, která je úzce spojena withNSCLC proliferace a přežití stav (7). Tyto receptory zahrnují C-met,receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR), c-kit a receptor inzulinového růstového faktoru (IGF-IR).

Kurkumin je přírodní aktivní složka extractedfrom suchý oddenek kurkumy Curcuma rod rostlin, kurkuma andCurcuma, s rozsáhlými farmakologické účinky, nízkou toxicitu, andgood tolerance, a vzhledem k jeho ekonomické hodnoty, se stala hotspot pro průzkum (8). Findingsof studium se zaměřením na kurkumin identifikovali celou řadu ofpharmacological činnosti, jako je protizánětlivé,anti-oxidace lipidů, anti-virus, anti-infekce, protinádorové,antikoagulans, anti-fibrózy jater a aterosklerózy, lowtoxicity a několika vedlejšími účinky (9-13).Účinek kurkuminu na NSCLC a podkladmolekulární mechanismus však zůstává nejasný. V této studii, weexamined na protinádorový účinek kurkuminu na mobilní proliferationand apoptózy lidských NSCLC a identifikovat možné tedy vztah mezi, tento efekt a miRNA-192-5p-modulovaný PI3K/Aktsignaling dráhy.

Materiály a metody

Chemické

Dulbecco ‚s modified Eagle‘ s medium (DMEM) a fetalcalf sérum (FBS) byly zakoupeny od Gibco (Carlsbad, CA, USA) a(Jižní Amerika). 3-(4,5-Dimethyl-thylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromidu (MTT) byl zakoupen od Sangon Biotech(Shanghai, Čína). Sada pro detekci apoptózy byla zakoupena odmbd Biosciences(San Jose, CA, USA). Test aktivity kaspázy-3byl zakoupen od společnosti Promega(Madison, WI, USA).

Buněčné kultury

normální Lidské NCL-H460 a BEAS-2E plic epithelialcells, a lidské A549 buňky rakoviny plic, byly získány z CellResource Středu Druhé Vojenské Lékařské Univerzity. Thesecells byly kultivovány v DMEM doplněném o 10% FBS (oba fromGibco), 100 U/ml penicilinu a 100 µg/ml streptomycin at37°C a humidifid inkubátoru s 5% CO2. Byly zkoumány koncentrace (5,10,20 a 40 µM) a časové periody (12 a 24 h) kurkuminu proti buňkám A549. Chemická struktura kurkuminu je znázorněna na obr.1.

životaschopnost Buněk analýza

Buňky byly nasazeny v hustotě z5×103/no v 96jamkové destičky. Stručně řečeno, buněčná viabilitabyl měřen testem MTT (sangon Biotech). Do každé jamky bylo přidáno deset mikrolitrů MTT (5 mg/l)a inkubováno po dobu 4 h při 37°C v ahumidifikovaném inkubátoru s 5% CO2. Dimethylsulfoxid (150 µl; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) byly přidány do každé jamky a míchány po dobu 20 minut při pokojové teplotě. Absorbance byla měřena při 450 nM pomocí čtečky amicroplate.

Annexin V-FITC/propidium jodid (PI)apoptóza analýzy

Buňky byly nasazeny v hustotě 1×106/no v 6-no desek. Kultivované buňky byly promytydvakrát ledově studeným PBS a poté obarveny Annexinem v-FITC a pomocí sady pro detekci apoptózy I podle instrukcí výrobce (BD Biosciences). Apoptóza byla analyzována pomocí flowcytometric pomocí softwaru CellQuest Pro (IVD) (oba z BDBiosciences).

Kaspázy-3 aktivační analýzy

Buňky byly nasazeny v hustotě z5×103/no v 96jamkové destičky. Aktivita kaspázy-3 byla měřena pomocí sady pro stanovení aktivity kaspázy-3 podle instrukcí výrobce (Promega). Sto microlitersreaction pufru s 10 µl substrátu Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroanilinu (pNA) byla přidána do 10 µl proteincell lyzátu/no a inkubovány při 37°C po dobu 6 h. Kaspázy-3 activitywas analyzovány na absorbance při 405 nm.

Buňky transfekce

miR-192-5p, anti-miR-192-5p a negativní controlmimics (miR-NC) byly zakoupeny od Sangon Biotech. Buňky byly naočkovány v 6-jamkových deskách a pěstovány na 50-60% soutoku priorto transfekce. Mimika byla transfektována Lipofectamine2000 do buněk podle pokynů výrobce (Invitrogen Life Technologies). Gen nebo protein byl izolován 24 hafter transfekce a používá se pro reverzní transkripci-kvantitativnípolymerázová řetězová reakce (RT-qPCR) nebo western blot analýza, resp.

RT-qPCR

Buňky byly nasazeny v hustotě z5×103/no v 96jamkové destičky. Celková RNA byla extrahována z buněk pomocí Trizolového činidla (Invitrogen Life Technologies).Koncentrace RNA byla stanovena pomocí spektrofotometru NanoDrop®ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA). Kvantifikace Mirna byla provedenaaqman miRNA assay kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Celková RNA byla podrobena syntéze cDNA s prvním vláknem a zkoumána pomocí soupravy PRIMESCRIPT RT reagent kit (oba z Takara, Shiga, Japonsko). qPCR byl proveden pomocí SYBR-Green PCR Master Mix (Takara)na systému ABI 7500HT. Použité primery jsou uvedeny v tabulce I.

tabulka i použité PCR primery.

Western blot analýza

Buňky byly nasazeny v hustotě z5×103/no v 96jamkové destičky. Kultivované buňky byly umytydvakrát s ledově studeným PBS a inkubovány s ledově studenou lýzovou pufrpo dobu 30 minut na ledu. Buněčná kapalina byla odebrána a odstředěna při 12 000 × g po dobu 10 minut při 4°C. Koncentrace rozpustného proteinu bylastanoveno pomocí sady pro stanovení proteinů BCA (Sigma, St. Louis, MO, USA). Celkové proteiny (10 µg) byly zpracovány na 12% dodecylsulfát sodný (SDS)-polyakrylamidové gely a přeneseny na polyvinylidendifluoridové (PVDF) membrány. Membrány byly blokovány tris-pufrovaným fyziologickým roztokem (TBS) obsahujícím 5% netučného mléka, aby se blokovala nespecifická vazebná místa. Membrány byly inkubovány s anti-PI3K (1: 1 500) a anti-Akt (1: 1000) (oba od Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) a anti-β-aktin (1:500;sangon Biotech) přes noc při 4°C. Po promytí 1% Tween-20/PBS byly membrány inkubovány sekundárnímiprotilátky (Tiangen, Peking, Čína) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě.Proteiny byly detekovány pomocí zvýšené chemiluminiscence (Vilber, Marne La Vallée, Francie).

Statistická analýza

statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru SPSS 19.0. Výsledky jsou prezentovány jako průměr ± SD. Výsledky byly analyzovány pomocí Studentova t-testu nebo jednosměrné analýzy rozptylu(ANOVA). P<0,05 bylo považováno za statisticky významné.

Výsledky

Kurkumin inhibuje životaschopnost A549cells

koncentrace (5, 10, 20 a 40 µM) plýtvalo období (12, 24 nebo 36 h), kurkumin proti A549 buňky wereassessed pomocí MTT testu. Obr.2 ukazuje, že ošetření buněk A549 pro 12, 24 nebo 48 hs 10, 20 a 40 µM kurkumin inhibuje životaschopnost buněk v adose – a časově závislý způsobem. Test MTT to naznačilkurkumin (20 a 40 µM) léčba po dobu 24 nebo 36 hodin vedla k nevýznamné životaschopnosti buněk ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 2).

Kurkumin indukuje apoptózu u A549cells

Před léčbou, apoptotických sazba ofcurcumin léčených (10, 20 nebo 40 µM) buněk A549 byla alsomeasured. Po ošetření s 20 nebo 40 µM kurkumin odpor 24 až h, apoptotických sazba výrazně zvýšená dávka-dependentmanner, ve srovnání s kontrolní skupinou (Obr. 3).

Kurkumin indukuje kaspázy-3 aktivity ofA549 buňky

K určení, zda kurkumin indukuje kaspázy-3activity z A549 buněk, kaspázy-3 aktivita byla měřena pomocí acaspase-3 activity assay kit. Kaspázy-3 aktivita také výrazně v závislosti na dávce po kurkumin (20 nebo 40µM) léčbě po dobu 24 h ve srovnání s kontrolní skupinou(Obr. 4). Tyto výsledky naznačilyže kurkumin indukoval apoptózu v buňkách A549.

miR-192-5p inhibuje životaschopnost buněk andinduces apoptóze buněk A549

zkoumat výraz a význam ofmiR-192-5p v normální lidské plicní epiteliální a buňky rakoviny plic,miR-192-5p relativní exprese byla detekována pomocí RT-qPCR.Obr. 5A ukazuje, že miR-192-5prelative výraz NCL-H460 buněk byl relativně nižší, že ofA549 buněk byla vyšší, s BEAS-2E buněk, které jsou nejvíce highlyexpressed.

analyzovat, zda miR-192-5p ovlivnil cellviability a apoptózy buněk A549, jsme transfektovaly miR-192-5pmimics do A549 buněk. Buňky transfektovaly s miR-192-5pmimics ukázal významné, 120-násobné zvýšení miR-192-5pexpression po 48 h transfekci, ve srovnání s kontrolní ormiR-SH skupiny (Obr. 5B).Nadměrná exprese miR-192-5p snížila životaschopnost buněk a549 ve srovnání s kontrolní skupinou nebo skupinou miR-NC(obr. 5C). Nadměrná exprese mir-192-5p však vyvolala apoptotickou rychlost buněk a549 ve srovnání s kontrolní skupinou nebo skupinou miR-NC (obr.5D).

Inhibice miR-192-5p potlačuje cellviability a indukuje apoptózu u buněk A549

K určení, zda anti-miR-192-5p ovlivňuje buňky, životaschopnost a apoptózy buněk A549, jsme transfectedanti-miR-192-5p napodobuje do A549 buněk. Úroveň exprese ofmiR-192-5p byla detekována pomocí RT-qPCR po 48 h transfekci.Mimika Anti-miR-192-5p účinně potlačila mir-192-5relativní expresi buněk a549 (obr.6A). Down-regulaci miR-192-5p povýšen životaschopnost buněk andinhibited apoptotických rychlost A549 buněk, respektive, v případě kontroly nebo miR-SH skupiny (Obr.6B a C).

Kurkumin inhibuje miR-192-5p geneexpression z A549 buňky

K určení, zda kurkumin ovlivňuje miR-192-5pgene výraz A549 buněk, hladina exprese miR-192-5pwas detekovány pomocí RT-qPCR po léčbě s kurkumin za 24h. Obr. 7 ukazuje, že expresionúroveň miR-192-5p byla výrazně zvýšena kurkuminem (20 nebo 40µM).

miR-192-5p inhibuje účinek ofcurcumin na životaschopnost buněk a indukuje apoptózu u buněk A549

prozkoumat, jak over-exprese miR-192-5pinfluenced efekt kurkuminu na životaschopnost buněk a theapoptotic rychlost A549 buněk, jsme transfektovaly miR-192-5p napodobuje intoA549 buněk. Obr. 8 ukazuje thatcurcumin potlačena životaschopnost buněk a zvýšení apoptotických míra A549 buněk po léčbě s kurkumin (20 µM) odpor 24 až h, respektive, ve srovnání s kontrolní skupinou. Účinek kurkuminu (20 µM)na životaschopnost buněk a apoptotickou rychlost 549 buněk byly výrazně sníženy a zvýšeny o mir-192-5pmimik ve srovnání se skupinou léčenou kurkuminem (obr. 8A).

Inhibice miR-192-5p potlačuje účinky kurkuminu na životaschopnost buněk a indukuje apoptózu u A549cells

prozkoumat, jak down-regulaci miR-192-5pinfluenced efekt kurkuminu na životaschopnost buněk a theapoptotic rychlost A549 buněk, jsme transfektovaly anti-miR-192-5p mimicsinto A549 buněk. Obr. 9 ukazuje thatcurcumin potlačena životaschopnost buněk a zvýšení apoptotických míra A549 buněk po léčbě s kurkumin (20 µM) odpor 24 až h, respektive, ve srovnání s kontrolní skupinou. Avšak účinek kurkuminu (20 µM) na životaschopnost buněk a rychlost a549 buněk byly výrazně zvýšeny a sníženy napodobeninami Anti-miR-192-5p ve srovnání se skupinou léčenou kurkuminem (obr.9A).

Kurkumin inhibuje PI3K/Akt proteinexpression z A549 buňky

detemine, zda kurkumin postižené PI3K/Aktprotein výraz A549 buněk, PI3K/Akt protein expressionwas detekované pomocí western blot analýzy po léčbě withcurcumin pro 24 h. Obr. 10 ukazuje, že exprese proteinu PI3K/Akt byla výrazně zvýšena kurkuminem (20 nebo 40 µM).

miR-192-5p přímo cíle PI3K/Akt ofA549 buňky

zkoumat, jak zvýšená exprese miR-192-5pinfluenced PI3K/Akt exprese proteinů z buněk A549, wetransfected miR-192-5p napodobuje do A549 buněk. Obr. 11A a B ukazuje, že curcuminsuppressed PI3K/Akt protein výrazy A549 buňky followingtreatment s kurkumin (20 µM) na 24 h ve srovnání s ovládací prvek skupiny. Účinek kurkuminu (20 µM) na thePI3K/Akt exprese proteinů z buněk A549 byla zřejmě snížena bymiR-192-5p napodobuje, ve srovnání s kurkumin-experimentální skupina(Obr. 11C A D).

Inhibice miR-192-5p zvyšuje thePI3K/Akt vyjádření A549 buňky

K určení, zda anti-miR-192-5p ovlivněn účinky kurkuminu na PI3K/Akt exprese proteinů z buněk A549, wetransfected anti-miR-192-5p napodobuje do A549 buněk. Obr. 12A a B ukazuje, že kurkuminpotlačil expresi proteinu PI3K / Akt buněk a549 po ošetření kurkuminem (20 µM) po dobu 24 hodin ve srovnání s kontrolní skupinou. Nicméně, účinek kurkuminu(20 µM) na PI3K/Akt exprese proteinů z buněk A549 wasmarkedly obohacen o anti-miR-192-5p napodobuje, respektive, v případě kurkumin-experimentální skupina (Obr.12C a D).

diskuse

jeden milion pacientů podlehne NSCLC ročně po celém světě a výskyt NSCLC se postupně zvyšuje.Přestože se řada studií v posledních letech zaměřila na NSCLC, nebylo dosaženo velkého pokroku, pokud jde o léčbu. Chirurgiezůstává nejúčinnější metodou léčby, ale z hlediskaprevence, stejně jako pro patogenezi NSCLC další studiemusí být provedeny (14,15). Nedávno identifikovali Liu et alže kurkumin inhibuje proliferaci a významně indukujebuněčná apoptotická rychlost buněk rakoviny žaludku (16). Ma et al to prokázalkurkumin inhibuje buněčný růst a invazi rakovinných buněk pankreatu (17). Souhrnně ourfindings ukázaly, že kurkumin potlačil životaschopnost buněk, indukovalbuněčnou apoptózu a zvýšil aktivitu kaspázy-3 buněk a549.Proto je kurkumin potenciálním lékem pro onkologii.

miRNA je třída RNA s malými molekulami, která má v poslední době významnou roli v regulaci genové exprese (18). Mirna geny jsouobvykle se nacházejí v intronových segmentech genu. Nicméně, miRNAs rovněž distribuovány mimo nekódujících exonů genu a theintergenic regionu, které byly nalezeny k účasti v různé známé onc ogenic cest, jako jsou p53, Bcl-2 a K-Ras(19). Bylo prokázáno, že>50% definovaných lidských miRNA se nachází v křehkých místech genomu a tato křehká místa jsou často spojena s výskytem NSCLC (20). Expresivní profily miRNA jsou spojeny s vývojem NSCLC. mir-34c, miR-145 a miR-142 mohou inhibovat NSCLC (5). Výsledky této studie naznačují, že relativní exprese buněk NCL-H460 mir-192-5p byla relativně nízká, u buněk A549 byla vyšší, přičemž buňky BEAS-2E byly nejvíce exprimovány. Nadměrná exprese miR-192-5psnížila životaschopnost buněk a zvýšila apoptotickou rychlosta549 buněk. Downregulace miR-192-5p zvýšila buněčnou životaschopnost a snížila apoptotickou rychlost buněk a549.Kurkumin navíc inhiboval expresi genu miR-192-5p a549cells. Nicméně, upregulace miR-192-5p výraz příjemců posílila vliv kurkuminu na životaschopnost buněk a apoptotických sazba ofA549 buněk, zatímco down-regulaci miR-192-5p expressionreversed efekt kurkuminu na A549 buněk. Naše výsledky byly shodné s výsledky jiných studií. Například Ye etal uvedl, že kurkumin podporuje buněčnou apoptózu aktivacímir-192-5p (21). Nicméně, pravděpodobné mechanismy, jak kurkumin ovlivňuje expresi miR-192-5p, jsou nejasné a budoucí studie k určení tohoto účinkuby měly být provedeny.

v posledních letech získal vliv dráhy PI3K/Aktsignaling na lidský NSCLC velkou pozornost(22). Aktivace PI3K/Aktsignaling cesta je velmi běžné v lidské NSCLC, což může promotethe výskyt rakoviny prostřednictvím různých mechanismů, includinggene mutace, snížení nádorových supresorových genů PTENexpression, PI3K mutace nebo amplifikace, Akt mutace oramplification a proteinem receptor aktivace (7). Aktivace jednotlivých komponent thispathway je hlavním důvodem pro nepříznivé prognóze NSCLC,což může vést k rezistenci na léčbu, tak inhibitionof této dráhy může zvrátit rezistenci a improvechemotherapy a radiační účinky in vivo (23). Údaje získané v prezentacistudie odhalila, že kurkumin potlačil proteinexpresi PI3K / Akt buněk a549. Upregulace exprese mir-192-5podtrhla expresi proteinu PI3K / Akt buněk a549.Downregulace exprese miR-192-5p může zvýšit expresi PI3K / Aktprotein buněk a549. Xu et al prokázalže kurkumin inhibuje invazi a migraci FTC133 buněk downregulace signální dráhy PI3K / Akt v tyreoidcancer buňkách (24). Xu et alsuggested, že kurkumin inhibuje proliferaci nádoru rakoviny plicpřes cestu PI3K / Akt (25).Schee et al ukázalo, že miR-22-3p, miR-143-3p andmiR-192-5p regulovány a byly zapojeny v APC, TGFß a PI3Kpathway v kolorektální nádorové buňky (26).

Na závěr tato studie se zaměřila na efekt ofcurcumin proti A549 buňky, inhibuje buněčnou proliferaci andinduced apoptózy lidských NSCLC prostřednictvím upregulace ofmiR-192-5p a potlačení PI3K/Akt signální dráhy. Závěry této studie naznačují, že kurkumin je apotenciálním cílem při léčbě NSCLC. Studie však odhalila určitá omezení, protože jsme nezkoumali detailní vztah mezi mir-192-5p a cestou PI3K/Akt v buňkách plicního karcinomu. K ověření výsledků je třeba provést další studie in vivo, klinické avelké statistické analýzy této studie.