distribuția Poisson, numită după matematicianul francez Sim Inktocon Denis Poisson, este probabilitatea apariției unui anumit număr de evenimente într-o perioadă de timp dată (fixă) dacă evenimentele apar la o rată constantă (cunoscută) și sunt independente de apariția evenimentului anterior. Se bazează pe o distribuție discretă a probabilității, unde setul de rezultate este discret sau finit, cum ar fi aruncarea unei monede sau aruncarea zarurilor.
în contextul unui experiment PCR digital, rezultatele discrete sunt prezența sau absența genei țintă. Miile de partiții individuale produse pentru o reacție PCR digitală sunt de așteptat să urmeze o distribuție Poisson, având în vedere că partițiile sunt monodispersate și conțin volumul echivalent al amestecului de probe.
dacă acești parametri nu sunt îndepliniți și partițiile prezintă polidispersitate, volumul amestecului de eșantioane din partiții va varia în mare măsură, iar partițiile mai mari pot conține mai multe ținte decât cele mai mici, scăzând precizia reacției PCR digitale.
în acest articol, vă prezentăm calculul matematic al Legii Poisson pentru un experiment PCR digital.
pentru un experiment PCR digital, un puț care conține eșantionul partiționat de interes și o genă țintă de cuantificat, trebuie mai întâi să definim următoarele variabile:
- \(N\): numărul total de partiții analizabile în puț
- \(p\): Numărul de partiții pozitive pentru gena țintă
- \ (v\): volumul partiției (în inqql), presupus a fi constant
- \ (d\): factorul de diluare utilizat pentru diluarea probei din stoc în puț
(de exemplu \(d = 10\) înseamnă că proba a fost diluată de 10 ori)
și apoi aceste probe suplimentare:
-
\(V = N \ v\): volumul total al partiției injectat în puț
-
\(C_{0}\) : concentrația genelor țintă în puț (în copii / ecqutl)
-
\(C = d \ C_{0}\): concentrația genelor țintă în stoc (în copii / inqutl)
-
\(\lambda = C_{0} \ v\): numărul mediu de gene țintă pe partiție în puț
distribuția genelor țintă încapsulate în partițiile sondei urmează o distribuție Poisson a parametrului \(\lambda\):
Proba (partiția încapsulează \(\text{$k$}\) gene țintă) \(=\dfrac {\lambda^k}{k!} e^{- \lambda}\)
se spune o partiție:
-
„partiție pozitivă” dacă a încapsulat cel puțin 1 genă țintă (caz în care vom observa o partiție fluorescentă la punctul final al procesului de amplificare, astfel încât cea mai mare parte a incertitudinii constă în această condiție „cel puțin o)
-
„partiție negativă” dacă a încapsulat 0 gena țintă (caz în care vom observa o partiție non-fluorescentă la punctul final al procesului de amplificare)
distribuția partițiilor pozitive în puț urmează o distribuție binomială a probabilității \(1 – e^{-\lambda}\):
- probabilitate (bine conține \(\text{$p$}\) partiții pozitive \ (={\rm C}_{N}^{P} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{n-p} \)
- probabilitate (partiția este negativă) \ ( =e^{- \lambda} \)
- probabilitate (partiția este pozitivă) \( = 1 – e^{-\lambda} \ } \)
dacă \(N\) este suficient de mare:
- Proba (partiția este pozitivă) \ (=\dfrac{p}{N} \)
deci formula pentru concentrația estimată a stocului este:
\ (C = – \ dfrac{d}{v} \ ln {\stânga (1 – \ dfrac{p}{N} \ dreapta)} \)
dacă trebuie să calculați automat concentrațiile estimate ale genelor țintă, împreună cu intervalul lor de încredere și incertitudinea relativă, este disponibil un instrument online: Legea Poisson: Mergând mai departe. Încearcă!
pentru mai multe informații privind curbele de incertitudine, precum și limitele de detecție și cuantificare, vă rugăm să consultați articolul: intervale dinamice de detecție & cuantificare.