Jüngste Fortschritte und nahe Zukunft der Insulinproduktion und -therapie

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat Insulin als „essentielle Medizin“ eingestuft; eine Grundmedizin, die „die vorrangigen Gesundheitsbedürfnisse der Bevölkerung befriedigt“ . Dies zeigt deutlich die Bedeutung von Insulin für die Behandlung menschlicher Krankheiten. Mit einer Zunahme von Diabetikern weltweit werden derzeit neuartige Methoden zur effektiveren Insulinproduktion und -anwendung verfolgt. Techniken zur Verbesserung des Insulin-Wirkstoffdesigns, der Biosynthese und der Verabreichung sind immer noch heiße Themen für die Bereiche medizinische Chemie, Pharmakologie und Pharmazie. Dieser Leitartikel befasst sich mit dem beliebten und interessanten Thema der jüngsten Fortschritte und Zukunftsperspektiven der Insulinproduktion und -therapie. Es soll Forschern und Klinikern auf dem Gebiet der Diabetes- und Insulintherapie eine wertvolle Ressource bieten.

Insulingeschichte, Bedeutung & Grundstruktur

Zion Market Research hat vorausgesagt, dass ein Markt für Insulin 43 US-Dollar erreichen wird.6 Milliarden USD im Jahr 2021 . Der Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel wird hauptsächlich durch Insulin reguliert, was Insulin zu einem wichtigen und essentiellen Medikament macht. 1921 von Banting entdeckt und als Polypeptidhormon identifiziert, wird Insulin von den Langerhans-Inseln in der Bauchspeicheldrüse produziert . Insulin wird von Betazellen der Bauchspeicheldrüse als eine einzige Kette von drei Peptiden A, B und C synthetisiert; bekannt als Prä-Proinsulin . Prä-Proinsulin wird gespalten und das Polypeptid wird in das Proinsulin bildende humane endoplasmatische Retikulum transloziert. Die Umwandlung in reifes Insulin wird durch proteolytische Enzyme erreicht, die als Prohormonkonvertasen PC1 / PC3 und PC2 bekannt sind und an zwei Positionen spalten, um das zentrale C-Peptid freizusetzen . Das resultierende reife Insulin besteht aus 51 Aminosäuren (30 Aminosäure-B-Ketten und 21 Aminosäure-A-Ketten), die durch zwei Interchain-Disulfidbindungen miteinander verbunden sind, um ein Monomer zu bilden . Zusätzlich enthält die A-Kette eine Intra-Ketten-Disulfidbindung. Spaltung von C-terminaler Aminosäure aus beiden Ketten, und die beiden Interchain Disulfidbindungen eliminieren Aktivität des reifen Insulins.

Fortschritt bei Insulinmutanten: Struktur & Funktionsbeziehung

Die Insulinsekretion im Körper erreicht 1 h nach dem Essen ihren Höhepunkt, gefolgt von einem Rückgang innerhalb der nächsten 2 h bei gesunden Personen . Im Gegensatz dazu benötigen Diabetiker Insulin, um eine bestimmte Spitzenzeit, einen bestimmten Wirkungseintritt und eine bestimmte Wirkungsdauer zu haben, um ein 24-Stunden-Insulinprofil zu erreichen und eine nächtliche Hypoglykämie zu vermeiden. Sobald Insulin injiziert wurde, bildet das Molekül ein Hexamer, das durch ein einzelnes Zinkion zusammengehalten wird . Die Hexamere dissoziieren in Dimere und Monomere, die diffundieren und die Kapillarwände durchdringen, um den Blutkreislauf zu erreichen. Die Geschwindigkeit der Dissoziation wird in verschiedenen Formulierungen manipuliert. Schnell wirkende Insulinformulierungen werden durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt, indem einzelne oder zwei Aminosäurereste im Insulinmolekül umgeschaltet werden. Die Aminosäuremodifikation verändert die Rezeptorbindung nicht, hemmt aber die Bildung von Insulindimeren und -hexameren . Größere Mengen an Insulinmonomeren werden leicht für eine schnelle Absorption zur Verfügung gestellt. Aktuelle Marktbeispiele sind Lispro und Aspart. Das Lispros-Analogon hat seine ProB28- und LysB29-Reste am C-terminalen Ende der B-Kette, die zu LysB28 und ProB29 umgekehrt sind. Insulin Aspart hat sein Prolin an Position 28 der B-Kette durch Asparaginsäure ersetzt. Die Modifikation von Aspart führt zu einer Erhöhung der Ladungsabstoßung, um die Bildung von Hexameren zu verhindern, wodurch ein schneller wirkendes Insulin entsteht. Zwischenanaloga, NPH (Neutral- Protamin- Haledon) und LENTE, zeigen einen Wirkungseintritt in der Nähe von 1-2 h, eine Spitzenwirkung von 6-10 h und eine Aktivitätsdauer von 10-16 h. Die Absorptionsraten bei NPH sind aufgrund der Zugabe von Protamin, einem kleinen argininreichen Kernprotein, verringert, das den Beginn verlangsamt und die Dauer der Insulinwirkung verlängert. LENTE erreicht das gleiche durch die Zugabe von Zink zu seiner Formulierung.

Fortschritt in der rekombinanten Insulinproduktion

Die rekombinante Humaninsulinproduktion wird hauptsächlich in E. coli- oder Saccharomyces cerevisiae-Expressionssystemen hergestellt . Anfänglich, E. coli war aufgrund seiner hohen Ausbeute und Wirtschaftlichkeit das bevorzugte Expressionssystem für die rekombinante Insulinproduktion in großem Maßstab . Die Produktionsmethode von Genetech verwendete chemisch synthetisierte cDNA, die für Insulin A- und B-Ketten getrennt kodiert. Somit wurden die beiden Ketten gereinigt und unter bevorzugten Bedingungen co-inkubiert, um das Wachstum der intakten Disulfidbindungsbildung zu beschleunigen . Alternativ verwendete Eli Lilly eine einzelne chemisch synthetisierte cDNA, die für humanes Proinsulin kodiert, mit anschließender Reinigung und Exzision des C-Peptids, wodurch ein aktives Insulinprodukt erhalten wurde . S. cerevisiae-Expressionssysteme enthalten konstruierte Insulinkonstrukte mit nativen A- und B-Ketten, denen das C-terminale B30-Threonin fehlt, das durch ein kleines synthetisches C-Peptid fusioniert oder verknüpft ist. Das Konstrukt wird durch die cDNA-Sequenz hergestellt, die mit der Alpha-Faktor-Signalsequenz in S. cerevisiae zur Expression von Proinsulin fusioniert ist. Dieses Proinsulinprodukt wird gereinigt und durch eine Trypsin-vermittelte Transpeptidationsreaktion in Gegenwart von Threoninester in aktives Insulin umgewandelt. Transgene Pflanzen werden aufgrund ihrer Kosteneffektivität, hochwertigen Proteinverarbeitung, Abwesenheit humaner Krankheitserreger und des Vorhandenseins eukaryotischer Maschinen für posttranslationale Modifikationen als Expressionssysteme verwendet . Rekombinantes Humaninsulin wurde in der Pflanze Arabidopsis thaliana über Ölkörper hergestellt . Ölkörper befinden sich in Ölsaaten, die aus einem hydrophoben Triacylglycerinkern bestehen, der von einer Phospholipidmembran und einer Außenwand aus Proteinen, den sogenannten Oleosinen, eingekapselt ist . Die Ölsaaten sind gentechnisch mit dem rekombinanten Protein Targeting Ölkörper als Oleosin Fusion entwickelt. Die weitere Verarbeitung umfasst die Trennung von Ölkörpern über eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung, um Chromatographieschritte bei der Reinigung von Insulin zu reduzieren . Danach wird der Ölkörper gereinigt, dann wird rekombinantes Insulin vom Oleosin-Fusionspartner gespalten und durch Trypsinverdau gereift, wodurch ein aktives Insulinprodukt erhalten wird. Ein alternativer Ansatz umfasst die Transformation von Tabak- und Salatchloroplasten mit humanem Proinsulin, das aus A-, B- und C-Ketten besteht, die mit der Choleratoxin-B-Untereinheit fusioniert sind . Die Produktion kann bis zu 47% Proinsulin in Salatblättern liefern, während Proinsulin aus Tabakblättern mit einer Reinheit von 98% extrahiert wurde . Der hohe Gehalt an biologisch aktivem Proinsulin, das in transgenen Pflanzen exprimiert wird, ermöglicht eine kostengünstige Produktion von injizierbarem und oralem Proinsulin .

Fortschritt in der Insulinanwendung

Insulin wird hauptsächlich subkutan über Durchstechflaschen und Spritzen verabreicht . Aufgrund der Einschränkungen bei der Verwendung einer Durchstechflasche oder Spritze zur Injektion begann die Entwicklung von Insulinpens zu steigen. Insulinpens sind wiederverwendbar, erhöhen die Compliance des Patienten und sind genauer . Fortschrittliche Insulinpens verfügen über eine intelligente Technologie, die die letzten 16 Dosen für den Patienten über integrierte Taschenrechner verfolgt . Injizierbares Insulin hat immer noch Nachteile, was die Forscher dazu veranlasst, neuartige Ansätze zur Insulinabgabe zu verfolgen. Inhalative Insulinprodukte werden derzeit von der FDA zur Zulassung geprüft, da Lungenwege Vorteile bieten. Inhaliertes Humaninsulin stammt aus rDNA und nutzt die Technosphären-Wirkstoffabgabe, um die Lunge zu erreichen . Einzelheiten zu dieser pulmonalen Insulinabgabe umfassen atemaktivierte Inhalatoren, die vordosierte Insulineinheitsdosen enthalten. Sobald dies auf den neutralen pH-Wert des Alveolarepithels trifft, löst es sich in flüssige Form auf . Ein Vorteil, der hier gesehen wird, ist das Fehlen von Magen-Darm-Peptidasen, die Insulin im GI-Trakt abbauen und anschließend das First-Pass-Metabolismus-System umgehen . Die transdermale Verabreichung von Insulin ist ein neuerer Ansatz, bei dem Iontophorese-, Sonophereis- oder Phonophereis-Techniken verwendet werden . Im Gegensatz zur Insulinabgabe wird die Stammzelltherapie als Option zur Umkehrung der Insulinresistenz erforscht. Stammzellen haben die Fähigkeit, sich in insulinproduzierende Zellen (IPCs) zu differenzieren, die Regeneration der Bauchspeicheldrüse zu verbessern und die Insulinresistenz zu verbessern – eine Alternative zur Inselzelltransplantation . Insbesondere mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben aufgrund ihrer Fähigkeit, β-Zellen der Pankreasinsel zu regenerieren, sie vor Apoptose zu schützen und die Insulinresistenz peripherer Gewebe zu verbessern, durch Schaffung einer optimalen Umgebung durch Sekretion parakriner Faktoren Bekanntheit erlangt . Molekular differenzieren MSCs in IPCs, indem sie Schlüsseltranskriptionsfaktoren wie Pdx-1, Ngn-3, NeuroD1, Pax4 und Pax6 im endokrinen Bereich der Bauchspeicheldrüse neu programmieren . Es wurden mehrere Experimente durchgeführt, um die Wirksamkeit der Verwendung von MSCs zu demonstrieren, mit Moriscot et al. als erster induzierte er die Differenzierung menschlicher Knochenmark-MSCs (BM-MSC) in IPCs . Vergleichende Studien differenzierten Wharton’s jelly-derived MSC (WJ-MSC) erfolgreich in reife β-Zell-Phänotypen . MSCs Fähigkeit, Regeneration der endogenen pankreatischen Insel β-Zelle über Sekretion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren zu fördern, die parakrine und autokrine Aktivitäten haben . In: Lee et al. beobachtete MSCs, die zur Insel von Streptozocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen migrierten, wo MSCs die Gewebereparatur beschleunigten, indem sie endogenen Zellen erlaubten, sich zu vermehren und ihre normale Funktion wiederzugewinnen . Diese alternativen Insulinanwendungen haben zu neuen Insulinprodukten auf dem Markt geführt.

Jüngste Fortschritte bei Insulinpatenten & Zukunft

Viele neuartige Methoden wurden patentiert, um die Insulinabgabe zu verbessern. Da die orale Insulinabgabe einem enzymatischen Abbau unterliegt, haben Wissenschaftler Nanopartikel-basierte Ansätze untersucht. Dieser Ansatz verbessert die Bioverfügbarkeit, indem Insulin vor gastrointestinalen Zuständen geschützt und die Permeabilität des Enzyms erhöht wird. Dies geschieht durch zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln oder parazellulären Transport über Tight Junctions. Ein Beispiel für ein aktuelles Nanopartikelpatent ist ein anionisches natürliches Polymer mit mittelkettigen Fettsäuren, die durch die Darmzellwand absorbiert werden. Das Polymer blockiert die Freisetzung von Insulin in den Magen, um den Abbau des Enzyms zu verhindern, und kann Tight Junctions öffnen, um die Insulinabsorption paracellulär zu verbessern .

Neben der Verwendung von Nanopartikeln als Methode zur Insulinabgabe wurden andere Systeme wie das bioresponsive Insulin Deliver System patentiert. Dieses System besteht aus einer künstlichen Betazelle mit einer glucoseempfindlichen Hydrogelmembran für die rückkopplungsgesteuerte Abgabe von Insulin. Diese Membran fängt Glucoseoxidaseenzyme in einem Hydrogelpolymer ein, senkt den pH-Wert der Membran und erhöht die Permeabilität der Hydrogelmembran für Insulin. Somit beschleunigt das System die Freisetzung von Insulin mit zunehmendem Glukosespiegel .

In jüngerer Zeit haben Forscher die Verwendung von Liposomen, Biliosomen und Proliposomen für die Insulinabgabe untersucht. Diese verkapseln Insulin unter Verwendung des geeigneten Phospholipid / Cholesterin-Verhältnisses, um das Austreten von Insulin aus dem Liposomenkern und den Abbau durch Enzyme zu verhindern. Bilosomen binden Gallensalze in die Liposomen ein, um das Bilosom gegen Gallensalzabbau im GI-Trakt zu stabilisieren und die Fließfähigkeit der Membran zu verbessern. Proliposomen werden durch Filmdispersion-Gefriertrocknung gebildet, um getrocknete und frei fließende Partikel zu bilden. Diese Methoden beinhalten die Verwendung von Liposomen zur Verbesserung der gastrointestinalen Resorption und der oralen Bioverfügbarkeit von Insulin .

Während dies nur einige Beispiele für die jüngsten Fortschritte bei der Insulinabgabe Patente sind, gibt es viele andere Produkte. Einige andere Beispiele umfassen die Einarbeitung von Insulin in eine Wasser-in-Öl-Emulsion durch Hochdruckhomogenisierung, um Insulin vor Magenabbau zu schützen, die Verkapselung von Insulin in einer kleinen Weichgelatinekapsel und die Beschichtung mit einem Polyacrylpolymer zum Schutz vor enzymatischem Abbau und viele weitere Produkte, die dazu beitragen, den Abbau von Insulin durch die raue gastrointestinale Umgebung zu verhindern .

Schlussfolgerung

Jüngste Fortschritte bei der Produktion von Insulin über MSCs haben sich als vielversprechend erwiesen. Die Ergebnisse der Prüfung der Wirksamkeit von MSC bei Tieren haben Vorteile gebracht, aber es gibt noch einige Nachteile. Zu den Vorteilen zählen die Fähigkeit von MSCs, hyperglykämische Episoden durch Differenzierung in IPCs, Pankreasregeneration und Verbesserung der Insulinresistenz in Tiermodellen zu bewältigen . Tiere sind keine Nachbildungen von menschlichen Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus, aber sie bieten ähnliche Wirkungsmechanismen für MSCs. Neben den traditionellen Insulinanwendungen haben neue Produktionssysteme Patienten mit Diabetes mellitus hervorragende Vorteile gebracht. Transgene Expressionssysteme auf pflanzlicher Basis ermöglichen die Produktion von Insulin mit hoher Kapazität bei niedrigen Produktionskosten. Dieser Vorteil wird von Vorteil sein, da die Zahl der Diabetiker weiter wächst.