este esențial să se controleze titrul viral în lucrul experimental cu viruși. Pentru a facilita comparațiile între studiile efectuate la diferite laboratoare, este de dorit utilizarea metodelor standard armonizate. Pentru herpesvirusul uman 6 (HHV-6) , un herpesvirus la care au fost expuși majoritatea oamenilor , metoda 50% a dozei de infecție a culturii tisulare (TCID50) este adesea utilizată pentru evaluarea titrului viral. O citire frecvent utilizată este inspecția oculară pentru efectele citopatice (CPE), adică mărirea celulelor infectate . Un obstacol în această abordare este că celulele se pot mări chiar și atunci când nu sunt infectate. Este deosebit de dificil la limita infecției în seria de titrare, deoarece celulele lărgite din cauza infecției tind să se mărească mai puțin odată cu diluarea crescută a virusului (fișier suplimentar 1: Figura S1). Testul de imunofluorescență (IFA) este o abordare alternativă de citire a inspecției oculare în evaluarea TCID50 sau pentru calcularea unităților infecțioase, adică fracțiunea de celule infectate . Citirea bazată pe IFA este mai distinctă în discriminarea infectată de celulele neinfectate, dar colorarea este laborioasă și un număr substanțial de celule trebuie să fie numărate pentru a obține valori fiabile. Monitorizarea celulelor individuale implică un risc de a interpreta greșit pozitivitatea unei celule, un dezavantaj atât al inspecției oculare, cât și al citirilor bazate pe IFA. Prin urmare, am dezvoltat și validat o abordare alternativă de citire a TCID50 în care creșterea încărcării ADN-ului viral este măsurată în fiecare godeu de titrare a plăcilor de cultură TCID50 folosind PCR cantitativ în timp real (Q-PCR). Această abordare a fost comparată cu inspecția oculară și citirile IFA ale TCID50 și cu abordarea unităților infecțioase descrisă mai sus.
HHV-6A (tulpina GS) a fost propagată în linia de celule T HSB-2 în GlutaMAX conținând mediu RPMI 1640 (Invitrogen, Regatul Unit) suplimentat cu ser fetal bovin 10% (HyClone, UT), penicilină 100 U/ml și streptomicină 100 hectog/ml (Invitrogen). Când aproximativ 50% din celulele vii s-au mărit, supernatantul a fost recoltat și congelat imediat în alicote la -80 CTC până la analiză. Ca martor, supernatantul viral de trecere 17 (P17) a fost inactivat de lumina UV timp de 20 min sau cu tratament termic la 56 centimetric C timp de 1 oră. Replicarea HHV – 6A în celulele HSB-2 a fost urmată timp de zece zile folosind Q-PCR (Applied Biosystems, Marea Britanie) așa cum s-a descris anterior . Înainte de analiza Q-PCR, ADN-ul a fost extras din suspensiile celulare folosind un kit pe bază de mărgele cu 96 de puțuri, conform protocolului producătorului (Kit de izolare a ARN-ului viral MagMAX-96, Biosystems aplicate). Pentru a evalua conținutul de ADN HHV-6A în loturile virale, Q-PCR a fost efectuat așa cum este descris mai sus după extracția ADN folosind coloane de filtrare (QIAGEN GmbH, Germania).
pentru a configura plăcile de cultură TCID50, suspensiile celulare de 40 de celule de 104 HSB-2 pe godeu au fost însămânțate în plăci de cultură cu 96 de godeuri cu fund rotund. Celulele au fost inoculate timp de 3-4 ore cu 160 ilqq de diluții de cinci ori de supernatant HHV-6A, șase replici pe diluție. Controalele simulate și medii au fost incluse în puțuri triplicate pe toate plăcile. Celulele au fost spălate o dată înainte de prelevarea a 50-70 unqq de suspensie celulară din fiecare godeu și depozitate la -80 unqqc ca probe de zero zile post-infecție (dpi). Suspensiile celulare rămase au fost incubate timp de șapte zile la 37 C. La șapte dpi, placa dpi zero dezghețată și cele șapte plăci dpi au fost supuse extracției ADN folosind kitul pe bază de mărgele descris mai sus. Ulterior, ADN-ul viral a fost cuantificat prin Q-PCR așa cum este descris mai sus.
pentru IFA, celulele au fost fixate pe lamele de sticlă cu un amestec 1:1 de acetonă și metanol la -20 CTC timp de 10 minute, blocate cu 5% ser de capră și 3% BSA în PBS și colorate cu un anticorp monoclonal primar de șoarece specific glicoproteinei HHV-6 gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD). Colorarea a fost vizualizată de un IgG anti-șoarece de capră conjugat Alexa 633 (Invitrogen). Colorarea cu 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (Vector laboratories, CA) a fost utilizată pentru vizualizarea nucleelor celulare. Lamele de acoperire au fost montate cu suporturi de montare (DAKO A/S, Danemarca), iar diapozitivele au fost analizate folosind un microscop confocal (Leica Microsystems, Germania). Fracțiunea celulelor infectate a fost determinată prin numărarea manuală. Dacă 1/3 din celule conțineau proteine virale, au fost numărate 25 de celule pe godeu și dacă <1/3 din celule conțineau proteine virale, au fost numărate 100 de celule pe godeu. Wells unde 2% din celulele colorate pozitiv au fost considerate infectate. Nivelul de creștere a încărcării ADN-ului viral în fiecare godeu a fost corelat cu colorarea IFA construind o formulă în software-ul Excel (Microsoft, WA). Această formulă întreabă dacă ADN-ul viral într-un anumit puț din placa TCID50 s-a deplasat de un anumit număr de ori care este setat și dacă același Puț a fost pozitiv în IFA sau nu.
pentru comparații cu citirea Q-PCR, toate plăcile TCID50 au fost evaluate prin inspecție oculară utilizând un microscop de contrast de fază de către doi inspectori independenți (TCID50 oculară). Wells au fost considerate infectate dacă a fost găsită cel puțin o celulă mărită. Pentru ambele abordări de citire, TCID50 a fost calculat conform formulei Reed și Muench .
rezultatele TCID50 determinate de Q-PCR (Q-PCR TCID50) au fost comparate cu evaluarea unităților infecțioase de către IFA (comunicare personală cu Louis Flamand) la trei puncte de timp pentru P19 și unul pentru P27. Pe scurt, 2,5*105 celule HSB-2 au fost inoculate așa cum este descris mai sus cu diferite diluții de virus în godeuri triplicate pentru fiecare diluție. La două dpi, celulele au fost supuse IFA care vizează proteina virală timpurie p41 (clona 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) așa cum este descris mai sus. Titrul viral, exprimat ca unități infecțioase per ml, a fost calculat prin înmulțirea fracțiunii de celule infectate cu numărul total de celule la dpi zero și factorii de diluare.
pentru a determina momentul optim pentru măsurătorile de creștere a încărcării ADN-ului viral, replicarea virusului a fost urmată timp de zece zile. Au fost necesare șapte zile pentru a atinge o creștere suficientă a ADN-ului viral (Figura 1) și, prin urmare, a fost aleasă ca punct de recoltare. Pentru a stabili punctul de tăiere al creșterii relative a ADN-ului viral corespunzător infecției pozitive, creșterea încărcării ADN-ului viral a fost corelată cu expresia proteinelor virale. IFA a fost efectuată la șapte dpi pe celule din fiecare godeu în trei plăci TCID50 pentru două loturi diferite de virus. Punctul optim de tăiere s-a dovedit a fi o creștere de zece ori a ADN-ului viral, unde corelația cu expresia proteinelor a fost observată în 93% din godeuri (Figura 2).
replicarea HHV-6A (tulpina GS) urmată de Q-PCR. Datele prezentate sunt rezultatele medii (sem-ul la suta) ale culturilor triplicate pentru fiecare multiplicitate de infectie (IMA). Liniile de conectare se întrerupe atunci când sarcina ADN-ului viral a scăzut sub limita de detecție.
determinarea punctului de tăiere pentru infecție. Punctul optim de reducere a infecției a fost o creștere de zece ori în cazul în care corelația cu expresia proteinelor a fost observată în 93% din godeuri de către IFA cu un anticorp care vizează proteina virală târzie gp116/54/64. Nici o proteină virală bine conținută în cazul în care încărcătura ADN-ului viral nu a crescut de zece ori. Datele prezentate sunt rezultate medii (sem la sută) de la trei plăci TCID50.
comparând valorile Q-PCR TCID50 cu cele oculare și IFA TCID50, un Q-PCR TCID50 a fost egal cu 1,41 ocular și 1,03 IFA TCID50 pe baza a 13 sau respectiv 5 evaluări. Q-PCR TCID50 nu a dat valori statistic diferite în comparație cu tcid50 ocular sau IFA (p = 0,41 sau, respectiv, p = 0,29) (testul t asociat) (Tabelul 1).
numerele de copiere a ADN-ului Viral sunt adesea folosite ca o estimare aproximativă a cantității de particule virale pe care le conține un anumit lot viral. Cu toate acestea, nu este sigur cât de bine aceasta corespunde infecțiozității. Pentru a evalua acest lucru, valorile TCID50 au fost comparate cu numerele de copiere a ADN-ului viral pentru lotul respectiv. Rapoartele medii ale încărcării ADN virale la valorile Q-PCR TCID50 în loturile de virus au fost similare pentru P17 și P19; 6,3*105 și 2,0*106 copii ADN virale pe TCID50 respectiv. Cu toate acestea, pentru P21, raportul a fost considerabil mai mare, 1,3*108 copii ADN virale pe TCID50 (Tabelul 1). Astfel, măsurarea ADN-ului viral în supernatanții lotului este insuficientă pentru a atribui corect infecțiozitatea unui lot și, prin urmare, trebuie efectuate teste biologice pentru a determina cu exactitate titrurile virale.
coeficientul mediu de variație intra-test (CV) pentru Q-PCR TCID50 a fost de 9%, determinat prin extracții duplicate paralele și Q-PCR ale trei plăci de cultură TCID50. Pentru TCID50 ocular, CV-ul intra-test a fost de 45%, determinat de un total de douăsprezece plăci de cultură TCID50 citite de doi evaluatori independenți. CV-ul intra-test a fost de 14% pentru IFA TCID50 determinat prin două colorări paralele ale celulelor din două serii. Pentru abordarea unităților infecțioase, CV-ul intra-test a fost de 43% determinat de patru colorări paralele ale celulelor dintr-o singură cursă. CV-ul mediu inter-test a fost de 73% pentru Q-PCR TCID50 și 66% pentru TCID50 ocular, determinat pentru trei loturi de virus rulate de cinci, trei și, respectiv, de trei ori. Pentru IFA TCID50 CV-ul inter-test a fost de 25%, determinat pentru un lot rulat de trei ori. Pentru abordarea unităților infecțioase, CV-ul inter-test a fost de 77%, determinat de trei serii separate pentru un lot.
în rezumat, metoda Q-PCR TCID50 descrisă aici se corelează bine cu expresia proteinelor virale și are astfel o specificitate ridicată pentru doza infecțioasă. Este mai robust decât tcid50 ocular, IFA TCID50 și abordarea unităților infecțioase, pe baza valorilor CV intra-test. CV-ul intra-test este în această setare o măsură a cât de precisă este o anumită abordare de citire și, prin urmare, este cea mai exactă valoare pentru comparațiile diferitelor metode. Pentru a adapta metoda, punctul de tăiere trebuie determinat pentru fiecare tulpină virală testată și pentru fiecare linie celulară utilizată. Abordarea de citire Q-PCR este mai laborioasă decât inspecția oculară, dar în opinia noastră considerabil mai puțin laborioasă decât IFA TCID50 și abordarea unităților infecțioase. Este mai scump în ceea ce privește resursele de laborator decât inspecția oculară, IFA TCID50 și abordarea unităților infecțioase. Cu toate acestea, datele noastre subliniază importanța efectuării testelor biologice pentru a determina cu exactitate titrurile virale, ceea ce ar putea justifica costul și forța de muncă. Mai mult, o mai bună standardizare a metodelor de evaluare a titrurilor virale utilizate în domeniul HHV-6 ar putea crește concordanța între diferite studii.