het is cruciaal om de virale titer onder controle te hebben in experimenteel werk met virussen. Om vergelijkingen tussen in verschillende laboratoria uitgevoerde studies te vergemakkelijken, is het wenselijk geharmoniseerde standaardmethoden toe te passen. Voor humaan herpesvirus 6 (HHV-6), Een β-herpesvirus dat de meeste mensen zijn blootgesteld aan, de 50% weefselkweek infectivity dose (TCID50) methode wordt vaak gebruikt voor virale titer beoordeling. Een veelgebruikte read-out is oculaire inspectie voor cytopathische effecten (CPE), dat wil zeggen uitbreiding van de geïnfecteerde cellen . Een obstakel met deze aanpak is dat cellen kunnen vergroten, zelfs wanneer niet besmet. Het is vooral moeilijk aan de rand van infectie in titratiereeks ‘ omdat cellen vergroot als gevolg van infectie de neiging hebben om minder te vergroten met verhoogde verdunning van het virus (aanvullend dossier 1: Figuur S1). Immunofluorescentie assay (IFA) is een alternatieve uitleesmethode voor oculaire inspectie bij tcid50-beoordeling of voor de berekening van infectieuze eenheden, d.w.z. de fractie van geïnfecteerde cellen . De IFA gebaseerde read-out is meer onderscheiden in het onderscheiden van geïnfecteerde van niet-geïnfecteerde cellen, maar het bevlekken is arbeidsintensief en een substantieel aantal cellen moet worden geteld om betrouwbare waarden te krijgen. De controle van individuele cellen impliceert een risico om de positiviteit van een cel verkeerd te interpreteren, een nadeel van zowel oculaire inspectie als IFA gebaseerde read-outs. Daarom hebben we een alternatieve uitleesbenadering van TCID50 ontwikkeld en gevalideerd waarbij de toename van virale DNA-belasting wordt gemeten in elke titratieput van tcid50-kweekplaten met behulp van real-time kwantitatieve PCR (Q-PCR). Deze benadering werd vergeleken met oculaire inspectie en IFA read-outs van TCID50, en met de hierboven beschreven aanpak van infectieuze eenheden.
HHV-6A (GS-stam) werd gekweekt in de T-cellijn HSB-2 in GlutaMAX met rpmi 1640 medium (Invitrogen, Verenigd Koninkrijk) aangevuld met 10% foetaal runderserum (HyClone, UT), 100 E/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine (Invitrogen). Wanneer ongeveer 50% van de levende cellen was vergroot, werd het supernatant geoogst en onmiddellijk ingevroren in aliquots bij -80°C tot de analyse. Als controlegroep werd het bovenstaande virus van passage 17 (P17) geïnactiveerd met UV-licht gedurende 20 minuten of met een warmtebehandeling bij 56°C gedurende 1 uur. HHV-6A-replicatie in HSB-2-cellen werd gedurende tien dagen gevolgd met behulp van Q-PCR (Applied Biosystems, Verenigd Koninkrijk) zoals eerder beschreven . Voorafgaand aan de Q-PCR-analyse werd DNA uit de cel suspensies geëxtraheerd met behulp van een 96-well plate bead-based kit volgens het Protocol van de fabrikant (Magmax-96 Viral RNA Isolation Kit, Applied Biosystems). Om het HHV-6A DNA-gehalte in de virale batches te beoordelen, werd Q-PCR uitgevoerd zoals hierboven beschreven na DNA-extractie met behulp van filterkolommen (QIAGEN GmbH, Duitsland).
om de tcid50-kweekplaten op te zetten, werden celsuspensies van 40 µl 104 HSB-2-cellen per putje gezaaid in ronde bodemcultuurplaten met 96 wells. De cellen werden gedurende 3-4 uur geïnoculeerd met 160 µl vijfvoudige verdunningen van HHV-6A supernatant, zes replicaten per verdunning. Mock en medium controles werden opgenomen in drievoudige putten op alle platen. De cellen werden eenmaal gewassen voordat 50-70 µl celsuspensie werd bemonsterd uit elke put en opgeslagen bij -80°C als zero day post infection (dpi) monsters. De resterende celsuspensies werden gedurende zeven dagen bij 37°C geïncubeerd. Bij zeven dpi werden de ontdooide nul-dpi-plaat en de zeven dpi-platen onderworpen aan DNA-extractie met behulp van de hierboven beschreven op kralen gebaseerde kit. Daarna werd het virale DNA gekwantificeerd door Q-PCR zoals hierboven beschreven.
voor IFA werden de cellen gedurende 10 minuten op glasplaten bevestigd met een 1:1 mengsel van aceton en methanol bij -20°C, Geblokkeerd met 5% geitenserum en 3% BSA in PBS, en gekleurd met een primair muis monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor het HHV-6 glycoproteïne gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD). De kleuring werd gevisualiseerd door een Alexa 633 geconjugeerde geit anti-muis IgG (Invitrogen). Kleuring met 4′, 6-diamidino-2-phenylindol (vectorlaboratoria, CA) werd gebruikt om de celkernen te visualiseren. Deksel slips werden gemonteerd met montagemedia (DAKO A / S, Denemarken), en de slides werden geanalyseerd met behulp van een confocale microscoop (Leica Microsystems, Duitsland). De fractie van geïnfecteerde cellen werd bepaald door handmatig te tellen. Indien ≥1/3 van de cellen viraal eiwit bevatte, werden ≥25 cellen per putje geteld en indien <1/3 van de cellen viraal eiwit bevatte, werden ≥100 cellen per putje geteld. Putten waar ≥2% van de cellen positief gekleurd werden beschouwd als besmet. Het niveau van virale DNA-belastingverhoging in elke put werd gecorreleerd aan de IFA-kleuring die een formule construeert in de software Excel (Microsoft, WA). Deze formule vraagt of het virale DNA in een bepaalde put in de tcid50 plaat is verschoven een bepaald aantal keren dat is ingesteld, en of dezelfde put was positief in IFA of niet.
voor vergelijkingen met de Q-PCR-uitlezing werden alle tcid50-platen beoordeeld door oculaire inspectie met behulp van een fasecontrastmicroscoop door twee onafhankelijke inspecteurs (oculaire TCID50). Putten werden als besmet beschouwd als ten minste één vergrote cel werd gevonden. Voor beide read-out benaderingen werd de TCID50 berekend volgens de Reed en Muench formule .
de tcid50-resultaten bepaald door Q-PCR (Q-PCR TCID50) werden vergeleken met de beoordeling van infectieuze eenheden door IFA (persoonlijke communicatie met Louis Flamand) op drie tijdstippen voor P19 en één voor P27. In het kort werden 2,5*105 HSB-2-cellen geïnoculeerd zoals hierboven beschreven met verschillende verdunningen van het virus in drievoudige putten voor elke verdunning. Bij twee dpi werden de cellen onderworpen aan IFA gericht op de vroege virale eiwit p41 (kloon 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Incl., CA) zoals hierboven beschreven. De virale titer, uitgedrukt in infectieuze eenheden per ml, werd berekend door de fractie geïnfecteerde cellen te vermenigvuldigen met het totale aantal cellen bij nul dpi en verdunningsfactoren.
om het optimale tijdstip voor metingen van de toename van de virale DNA-belasting te bepalen, werd virusreplicatie gedurende tien dagen gevolgd. Zeven dagen waren nodig om voldoende toename van viraal DNA te bereiken (figuur 1) en werd daarom gekozen als het tijdstip van de oogst. Om het snijpunt van relatieve virale DNA-toename in te stellen dat overeenkomt met een positieve infectie, werd de virale DNA-belastingstijging gecorreleerd met virale eiwitexpressie. IFA werd uitgevoerd bij zeven dpi op cellen uit elke put in drie tcid50 platen voor twee verschillende viruspartijen. Het optimale snijpunt werd gevonden om een tien tijdsverhoging van viraal DNA te zijn, waar de correlatie met eiwitexpressie in 93% van de putten werd gezien (Figuur 2).
replicatie van HHV-6A (GS-stam) gevolgd door Q-PCR. De getoonde gegevens zijn gemiddelde resultaten (± SEM) van drievoudige culturen voor elke multipliciteit van besmetting (MOI). De verbindingslijnen stoppen wanneer de virale lading van DNA onder de opsporingslimiet daalde.
bepaling van cut-point voor infectie. De optimale cut-point voor infectie werd gevonden om een tien keer toename waar de correlatie met eiwitexpressie werd gezien in 93% van de putten door IFA met een antilichaam gericht op de late virale eiwit gp116/54/64. Geen goed bevatte virale eiwit waar de virale DNA belasting niet tien keer was toegenomen. De getoonde gegevens zijn gemiddelde resultaten (± SEM) van drie tcid50 platen.
bij vergelijking van de waarden van Q-PCR TCID50 met oculair en IFA TCID50 kwam één Q-PCR TCID50 overeen met 1,41 oculair en 1,03 IFA tcid50 op basis van respectievelijk 13 of 5 beoordelingen. Q-PCR TCID50 gaf geen statistisch verschillende waarden in vergelijking met oculair of IFA TCID50 (p = 0,41 of P = 0,29 respectievelijk) (gepaarde t-test) (Tabel 1).
Virale DNA-kopie-nummers worden vaak gebruikt als een ruwe schatting van het bedrag van virale deeltjes een bepaalde virale batch bevat. Het is echter onzeker hoe goed dit overeenkomt met infectiviteit. Om dit te beoordelen, werden TCID50-waarden vergeleken met de virale DNA-kopieernummers voor de respectievelijke batch. De gemiddelde ratio ‘ s van virale DNA-belasting tot Q-PCR TCID50-waarden in de virusgroepen waren vergelijkbaar voor respectievelijk P17 en P19; 6,3*105 en 2,0*106 virale DNA-kopieën per tcid50. Voor P21 was de verhouding echter aanzienlijk hoger, 1,3*108 virale DNA kopieën per TCID50 (Tabel 1). Het meten van viraal DNA in de supernatanten van de partij is dus onvoldoende om de infectiviteit van een partij correct toe te wijzen en daarom moeten biologische tests worden uitgevoerd om de virale titers nauwkeurig te bepalen.
de gemiddelde intra-assay variatiecoëfficiënt (CV) voor Q-PCR TCID50 was 9%, bepaald door parallelle duplicaatextracties en Q-PCR ‘ s van drie tcid50-kweekplaten. Voor oculaire TCID50 was de intra-assay CV 45%, bepaald door in totaal twaalf tcid50-kweekplaten die door twee onafhankelijke beoordelaars werden gelezen. De intra-assay CV was 14% voor IFA TCID50 bepaald door twee parallelle kleuring van cellen uit twee runs. Voor de infectieuze eenheden nadering was de intra-assay CV 43% bepaald door vier parallelle kleuring van cellen uit één run. De gemiddelde CV van de inter-assay was 73% voor Q-PCR TCID50 en 66% voor oculaire TCID50, bepaald voor drie virusgroepen die respectievelijk vijf, drie en drie keer werden uitgevoerd. Voor IFA TCID50 was de CV voor de Inter-assay 25%, bepaald voor één partij driemaal. Voor de benadering van de infectieuze eenheden was de Inter-assay CV 77%, bepaald door drie afzonderlijke runs voor één batch.
samengevat correleert de hier beschreven Q-PCR TCID50 methode goed met de expressie van virale eiwitten en heeft dus een hoge specificiteit voor infectieuze dosis. Het is robuuster dan oculaire TCID50, IFA TCID50 en de aanpak van infectieuze eenheden, gebaseerd op de intra-assay CV-waarden. De intra-assay CV is in deze instelling Een maat voor hoe nauwkeurig een bepaalde uitleesmethode is en daarom is de meest nauwkeurige waarde voor vergelijkingen van de verschillende methoden. Om de methode aan te passen, moet het snijpunt worden bepaald voor elke geteste virusstam en elke gebruikte cellijn. De Q-PCR read-out benadering is arbeidsintensiever dan oculaire inspectie, maar naar onze mening aanzienlijk minder arbeidsintensief dan IFA TCID50 en de infectieuze eenheden aanpak. Het is duurder in termen van laboratoriummiddelen dan oculaire inspectie, IFA TCID50 en de infectieuze eenheden aanpak. Nochtans, benadrukken onze gegevens het belang van het uitvoeren van biologische analyses om virale titers nauwkeurig te bepalen, die de kosten en Arbeid zouden kunnen rechtvaardigen. Bovendien zou een betere standaardisatie van de virale titerbeoordelingsmethoden die binnen het HHV-6-veld worden gebruikt, de concordantie tussen verschillende studies kunnen vergroten.