det er afgørende at have kontrol over den virale titer i eksperimentelt arbejde med vira. For at lette sammenligninger mellem undersøgelser udført på forskellige laboratorier er det ønskeligt at anvende harmoniserede standardmetoder. For humant herpesvirus 6 (HHV-6), et kursherpesvirus, som de fleste mennesker har været udsat for, anvendes 50% vævskulturinfektionsdosis (TCID50)-metoden ofte til viral titervurdering. En almindeligt anvendt udlæsning er okulær inspektion for cytopatiske effekter (CPE), dvs .udvidelse af de inficerede celler. En hindring med denne tilgang er, at celler kan forstørres, selv når de ikke er inficeret. Det er især vanskeligt ved grænsen for infektion i titreringsserier’, da celler forstørret på grund af infektion har tendens til at forstørre mindre med øget fortynding af virussen (yderligere fil 1: Figur S1). Immunofluorescensassay (IFA) er en alternativ udlæsningsmetode til okulær inspektion i tcid50-vurdering eller til beregning af infektiøse enheder, dvs .fraktionen af inficerede celler. Den IFA-baserede udlæsning er mere tydelig ved at skelne inficeret fra uinficerede celler, men farvningen er besværlig, og et betydeligt antal celler skal tælles for at få pålidelige værdier. Overvågningen af individuelle celler indebærer en risiko for fejlagtigt at fortolke en celles positivitet, en ulempe ved både okulær inspektion og IFA-baserede aflæsninger. Derfor udviklede og validerede vi en alternativ udlæsningsmetode for TCID50, hvor stigningen i viral DNA-belastning måles i hver titreringsbrønd af TCID50-kulturplader ved hjælp af kvantitativ PCR i realtid. Denne fremgangsmåde blev sammenlignet med okulær inspektion og IFA-aflæsninger af TCID50 og med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde for infektiøse enheder.
HHV-6a (GS-stamme) blev opformeret i T-cellelinjen HSB-2 i Glutamaks indeholdende rpmi 1640 medium (Invitrogen, Det Forenede Kongerige) suppleret med 10% føtal bovint serum (HyClone, UT), 100 U/ml penicillin og 100 liter/ml streptomycin (Invitrogen). 50% af de levende celler var forstørret, blev supernatanten høstet og frosset straks i alikvoter ved -80 liter C indtil analyse. Som kontroller blev virussupernatant af passage 17 (P17) inaktiveret af UV-lys i 20 minutter eller med varmebehandling ved 56 liter C i 1 time. Hhv-6A-replikation i HSB-2-celler blev fulgt i ti dage ved anvendelse af PCR (Applied Biosystems, United Kingdom) som tidligere beskrevet . Før PCR-analyse blev DNA ekstraheret fra cellesuspensionerne ved hjælp af et 96-brøndspladebaseret sæt i henhold til producentens protokol (Magmaks-96 viralt RNA-Isolationssæt, Applied Biosystems). For at vurdere hhv-6A-DNA-indholdet i virusbatcherne blev K-PCR udført som beskrevet ovenfor efter DNA-ekstraktion ved hjælp af filterkolonner (ki GmbH, Tyskland).
for at opsætte tcid50-kulturpladerne blev cellesuspensioner af 40 liter 104 HSB-2-celler pr. Cellerne blev inokuleret i 3-4 timer med 160 liter fem gange fortyndinger af hhv-6a supernatant, seks replikater pr.fortynding. Mock og medium kontrol blev inkluderet i tre eksemplarer brønde på alle plader. Cellerne blev vasket en gang, før 50-70 liter cellesuspension blev udtaget fra hver brønd og opbevaret ved -80 liter C som nul dag efter infektion (dpi) prøver. De resterende cellesuspensioner blev inkuberet i syv dage ved 37 liter C. Ved syv dpi blev den optøede nul dpi-plade og de syv dpi-plader underkastet DNA-ekstraktion under anvendelse af det perlebaserede kit beskrevet ovenfor. Derefter blev det virale DNA kvantificeret ved hjælp af K-PCR som beskrevet ovenfor.
for IFA blev cellerne fikseret på glasrutschebaner med en 1:1 blanding af acetone og methanol ved -20 liter C i 10 minutter, blokeret med 5% gedeserum og 3% BSA i PBS og farvet med et primært monoklonalt antistof fra mus, der er specifikt for HHV-6 glycoprotein gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD). Farvningen blev visualiseret af en Aleksa 633 konjugeret ged anti-mus IgG (Invitrogen). Farvning med 4′, 6-diamidino-2-phenylindol (Vektorlaboratorier, CA) blev brugt til at visualisere cellekernerne. Dækslipene blev monteret med monteringsmedier (DAKO A/S, Danmark), og gliderne blev analyseret ved hjælp af et konfokalt mikroskop (Leica Microsystems, Tyskland). Fraktionen af inficerede celler blev bestemt ved manuel tælling. Hvis 1/3 af cellerne indeholdt viralt protein, blev der talt 25 celler pr. brønd, og hvis < 1/3 af cellerne indeholdt viralt protein, blev der talt 100 celler pr.brønd. Brønde, hvor 2% af cellerne farvede positive blev betragtet som inficerede. Niveauet af viral DNA-belastningsforøgelse i hver brønd var korreleret med IFA-farvningen, der konstruerede en formel i programmet. Denne formel spørger, om det virale DNA i en bestemt brønd i tcid50-pladen har skiftet et vist antal gange, som er indstillet, og om den samme brønd var positiv i IFA eller ej.
til sammenligning med PCR-aflæsningen blev alle tcid50-plader vurderet ved okulær inspektion ved hjælp af et fasekontrastmikroskop af to uafhængige inspektører (okulær TCID50). Brønde blev betragtet som inficerede, hvis mindst en forstørret celle blev fundet. For begge udlæsningsmetoder blev TCID50 beregnet i henhold til Reed-og Muench-formlen .
TCID50-resultaterne bestemt af K-PCR (K-PCR TCID50) blev sammenlignet med IFA ‘ s vurdering af infektiøse enheder (personlig kommunikation med Louis Flamand) på tre tidspunkter for P19 og et for P27. Kort fortalt blev 2,5*105 HSB-2-celler inokuleret som beskrevet ovenfor med forskellige fortyndinger af virus i triplikatbrønde for hver fortynding. Ved to dpi blev cellerne udsat for IFA rettet mod det tidlige virale protein p41 (klon 9A5D12, Santa Cruse Biotech. Inc., CA) som beskrevet ovenfor. Ml blev beregnet ved at multiplicere fraktionen af inficerede celler med det totale antal celler ved nul dpi og fortyndingsfaktorer.
for at bestemme det optimale tidspunkt for målinger af viral DNA-belastning blev virusreplikation fulgt i ti dage. Syv dage var påkrævet for at nå tilstrækkelig stigning i viralt DNA (Figur 1) og blev derfor valgt som høsttidspunkt. For at indstille skærepunktet for relativ viral DNA-stigning svarende til positiv infektion blev den virale DNA-belastningsforøgelse korreleret med viral proteinekspression. IFA blev udført ved syv dpi på celler fra hver brønd i tre TCID50-plader til to forskellige virusbatcher. Det optimale skærepunkt viste sig at være en ti-gangs stigning i viralt DNA, hvor korrelationen til proteinekspression blev set i 93% af brøndene (figur 2).
replikering af hhv-6A (GS-stamme) efterfulgt af PCR. De viste Data er gennemsnitlige resultater (kurs SEM) af triplikatkulturer for hver multiplicitet af infektion (MOI). Forbindelseslinjer afbrydes, når den virale DNA-belastning faldt under detektionsgrænsen.
bestemmelse af cut-point for infektion. Det optimale skærepunkt for infektion viste sig at være en ti gange stigning, hvor korrelationen til proteinekspression blev set i 93% af brøndene af IFA med et antistof rettet mod det sene virale protein gp116/54/64. Intet godt indeholdt viralt protein, hvor den virale DNA-belastning ikke var steget ti gange. De viste Data er gennemsnitlige resultater (Kurt sem) fra tre tcid50-plader.
sammenligning af værdierne for K-PCR TCID50 med okulær og IFA TCID50 svarede En K-PCR TCID50 til 1,41 okulær og 1,03 IFA TCID50 baseret på henholdsvis 13 eller 5 vurderinger. Tcid50 gav ikke statistisk forskellige værdier sammenlignet med okulær eller IFA TCID50 (henholdsvis p = 0,41 eller p = 0,29) (parret t-test) (tabel 1).
virale DNA-kopinumre bruges ofte som et groft skøn over mængden af virale partikler, som en bestemt viral batch indeholder. Det er imidlertid usikkert, hvor godt dette svarer til infektivitet. For at vurdere dette blev tcid50-værdier sammenlignet med de virale DNA-kopieringsnumre for den respektive batch. De gennemsnitlige forhold mellem viral DNA-belastning og PCR TCID50-værdier i virusbatcherne var ens for henholdsvis P17 og P19; 6,3*105 og 2,0*106 virale DNA-kopier pr.TCID50. For P21 var forholdet imidlertid betydeligt højere, 1,3*108 virale DNA-kopier pr.TCID50 (tabel 1). Måling af viralt DNA i batchs supernatanter er således utilstrækkelig til korrekt at tildele infektiviteten af et parti, og derfor bør biologiske analyser udføres for nøjagtigt at bestemme virale titere.
den gennemsnitlige intra-assay variationskoefficient (CV) for K-PCR TCID50 var 9%, bestemt ved parallelle duplikatekstraktioner og K-PCR ‘ er af tre TCID50 kulturplader. For okulær TCID50 var intra-assay CV 45%, bestemt af i alt tolv tcid50 kulturplader læst af to uafhængige bedømmere. Intra-assay CV var 14% for IFA TCID50 bestemt ved to parallelle farvning af celler fra to kørsler. For de infektiøse enheder nærmer sig det intra-assay CV var 43% bestemt ved fire parallelle farvning af celler fra et løb. Det gennemsnitlige inter-assay CV var 73% for PCR TCID50 og 66% for okulær TCID50, bestemt for tre virusbatcher, der kørte henholdsvis fem, tre og tre gange. For IFA TCID50 var Inter-assay CV 25%, bestemt for en batchkørsel tre gange. For de infektiøse enheder var inter-assay CV 77%, bestemt af tre separate kørsler for en batch.
sammenfattende korrelerer den her beskrevne h-PCR TCID50-metode godt med ekspression af virale proteiner og har således høj specificitet for infektiøs dosis. Det er mere robust end okulær TCID50, IFA TCID50 og den infektiøse enheder tilgang, baseret på intra-assay CV-værdier. Intra-assay CV ‘ et er i denne indstilling et mål for, hvor præcis en bestemt udlæsningsmetode er og er derfor den mest nøjagtige værdi for sammenligninger af de forskellige metoder. For at tilpasse metoden skal skærepunktet bestemmes for hver testet viral stamme og hver anvendt cellelinie. PCR-udlæsningsmetoden er mere besværlig end okulær inspektion, men efter vores mening betydeligt mindre besværlig end IFA TCID50 og de infektiøse enheder tilgang. Det er dyrere med hensyn til laboratorieressourcer end okulær inspektion, IFA TCID50 og de infektiøse enheder nærmer sig. Imidlertid, vores data understreger vigtigheden af at udføre biologiske analyser for nøjagtigt at bestemme virale titere, hvilket kan berettige omkostninger og arbejdskraft. Desuden kan bedre standardisering af virale titervurderingsmetoder anvendt inden for HHV-6-feltet øge overensstemmelsen mellem forskellige undersøgelser.