Es crucial tener control del título viral en el trabajo experimental con virus. Para facilitar las comparaciones entre los estudios realizados en diferentes laboratorios, es conveniente utilizar métodos normalizados armonizados. Para el herpesvirus humano 6 (HHV-6) , un herpesvirus β al que la mayoría de las personas han estado expuestas , el método de dosis de infectividad de cultivo de tejido al 50% (DICT50) se usa a menudo para evaluar los títulos virales. Una lectura de uso común es la inspección ocular para detectar efectos citopáticos (EPC), es decir, agrandamiento de las células infectadas . Un obstáculo con este enfoque es que las células pueden agrandarse incluso cuando no están infectadas. Es especialmente difícil en el límite de la infección en la serie de titulación, ya que las células agrandadas debido a la infección tienden a agrandarse menos con el aumento de la dilución del virus (Archivo adicional 1: Figura S1). El ensayo de inmunofluorescencia (IFA) es un método de lectura alternativo para la inspección ocular en la evaluación de la DICT50 o para el cálculo de unidades infecciosas, es decir, la fracción de células infectadas . La lectura basada en IFA es más distintiva en la distinción de células infectadas de células no infectadas, pero la tinción es laboriosa y se necesita contar un número sustancial de células para obtener valores confiables. El monitoreo de células individuales implica un riesgo de malinterpretar la positividad de una célula, una desventaja tanto de la inspección ocular como de las lecturas basadas en IFA. Por lo tanto, desarrollamos y validamos un enfoque de lectura alternativo de la DICT50 en el que el aumento de la carga de ADN viral se mide en cada pocillo de titulación de placas de cultivo de DICT50 utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR). Este enfoque se comparó con la inspección ocular y las lecturas de IFA de DICT50, y con el enfoque de unidades infecciosas descrito anteriormente.
HHV-6A (cepa GS) se propagó en la línea de células T HSB-2 en GlutaMAX que contenía medio RPMI 1640 (Invitrogen, Reino Unido) suplementado con suero fetal bovino al 10% (HyClone, UT), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Cuando aproximadamente el 50% de las células vivas se habían agrandado, el sobrenadante se recolectó y congeló inmediatamente en alícuotas a -80°C hasta el análisis. Como controles, el sobrenadante del virus del paso 17 (P17) se inactivó con luz UV durante 20 minutos o con tratamiento térmico a 56°C durante 1 h. La replicación de HHV – 6A en células HSB-2 se siguió durante diez días utilizando Q-PCR (Applied Biosystems, Reino Unido) como se describió anteriormente . Antes del análisis de Q-PCR, se extrajo ADN de las suspensiones celulares utilizando un kit basado en bolas de placa de 96 pocillos de acuerdo con el protocolo del fabricante (Kit de Aislamiento de ARN Viral MagMAX-96, Applied Biosystems). Para evaluar el contenido de ADN de HHV-6A en los lotes virales, se realizó Q-PCR como se describió anteriormente después de la extracción de ADN utilizando columnas de filtro (QIAGEN GmbH, Alemania).
Para configurar las placas de cultivo TCID50, se sembraron suspensiones de células de 40 µl 104 células HSB-2 por pocillo en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se inocularon durante 3-4 horas con 160 µl de diluciones quintuplicadas de sobrenadante HHV-6A, seis réplicas por dilución. Se incluyeron controles simulados y medios en pocillos triplicados en todas las placas. Las células se lavaron una vez antes de que se tomaran muestras de 50-70 µl de suspensión celular de cada pocillo y se almacenaran a -80°C como muestras de día cero después de la infección (dpi). Las suspensiones de celdas restantes se incubaron durante siete días a 37°C. A siete dpi, la placa de cero dpi descongelada y las placas de siete dpi se sometieron a extracción de ADN utilizando el kit basado en perlas descrito anteriormente. A partir de entonces, el ADN viral se cuantificó mediante Q-PCR como se describió anteriormente.
Para IFA, las células se fijaron en portaobjetos de vidrio con una mezcla 1:1 de acetona y metanol a -20°C durante 10 minutos, bloqueadas con suero de cabra al 5% y ASC al 3% en PBS, y teñidas con un anticuerpo monoclonal primario de ratón específico de la glicoproteína HHV-6 gp116/54/64 (Biotecnologías Avanzadas, MD). La tinción fue visualizada por un IgG conjugado Alexa 633 de cabra anti-ratón (Invitrogen). Se utilizó tinción con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Laboratorios Vectoriales, CA) para visualizar los núcleos celulares. Los portaobjetos se montaron con medios de montaje (DAKO A / S, Dinamarca), y los portaobjetos se analizaron con un microscopio confocal (Leica Microsystems, Alemania). La fracción de células infectadas se determinó mediante recuento manual. Si ≥1/3 de las células contenían proteínas virales, se contaron ≥25 células por pocillo y si <1/3 de las células contenían proteínas virales, se contaron ≥100 células por pocillo. Los pocillos en los que ≥2% de las células con tinción positiva se consideraron infectados. El nivel de aumento de la carga de ADN viral en cada pozo se correlacionó con la tinción IFA construyendo una fórmula en el software Excel (Microsoft, WA). Esta fórmula pregunta si el ADN viral en un determinado pocillo de la placa TCID50 ha cambiado un cierto número de veces que se establece, y si el mismo pocillo fue positivo en IFA o no.
Para las comparaciones con la lectura de Q-PCR, todas las placas de DICT50 se evaluaron mediante inspección ocular utilizando un microscopio de contraste de fase por dos inspectores independientes (DICT50 ocular). Los pozos se consideraban infectados si se encontraba al menos una célula agrandada. Para ambos enfoques de lectura, la DICT50 se calculó de acuerdo con la fórmula de Lengüeta y Muench .
Los resultados de la DICT50 determinada por Q-PCR (Q-PCR DICT50) se compararon con la evaluación de unidades infecciosas por IFA (comunicación personal con Louis Flamand) en tres puntos de tiempo para P19 y uno para P27. En resumen, se inocularon 2,5 * 105 células HSB-2 como se describió anteriormente con varias diluciones de virus en pocillos triplicados para cada dilución. A dos dpi, las células se sometieron a IFA dirigida a la proteína viral temprana p41 (clon 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) como se describe anteriormente. El título viral, expresado en unidades infecciosas por ml, se calculó multiplicando la fracción de células infectadas por el número total de células a cero dpi y factores de dilución.
Para determinar el punto de tiempo óptimo para las mediciones de aumento de la carga de ADN viral, se realizó un seguimiento de la replicación del virus durante diez días. Se necesitaron siete días para alcanzar un aumento suficiente del ADN viral (Figura 1) y, por lo tanto, se eligió como punto de tiempo de cosecha. Para establecer el punto de corte del aumento relativo del ADN viral correspondiente a la infección positiva, el aumento de la carga de ADN viral se correlacionó con la expresión de proteínas virales. El IFA se realizó a siete dpi en células de cada pocillo en tres placas de DICT50 para dos lotes de virus diferentes. El punto de corte óptimo fue un aumento de diez veces en el ADN viral, donde la correlación con la expresión de proteínas se observó en el 93% de los pocillos (Figura 2).
Replicación de HHV – 6A (cepa GS) seguida de Q-PCR. Los datos mostrados son los resultados medios (± SEM) de cultivos triplicados para cada multiplicidad de infecciones (MOI). Las líneas de conexión se interrumpen cuando la carga de ADN viral cae por debajo del límite de detección.
Determinación de corte punto de infección. Se encontró que el punto de corte óptimo para la infección era un aumento de diez veces, donde la correlación con la expresión de proteínas se observó en el 93% de los pocillos por IFA con un anticuerpo dirigido a la proteína viral tardía gp116/54/64. Ninguna proteína viral bien contenida donde la carga de ADN viral no había aumentado diez veces. Los datos mostrados son los resultados medios (± SEM) de tres placas de DICT50.
la Comparación de los valores de Q-PCR TCID50 oculares y de IFA TCID50, uno Q-PCR TCID50 igualado 1.41 ocular y 1.03 IFA TCID50 basado en 13 o 5 evaluaciones respectivamente. La DICT50 Q-PCR no dio valores estadísticamente diferentes en comparación con la DICT50 ocular o IFA (p = 0,41 o p = 0,29, respectivamente) (prueba t emparejada) (Tabla 1).
Los números de copias de ADN viral a menudo se usan como una estimación aproximada de la cantidad de partículas virales que contiene un lote viral en particular. Sin embargo, no se sabe con certeza qué tan bien se corresponde con la infectividad. Para evaluar esto, se compararon los valores de la DICT50 con los números de copias de ADN viral para el lote respectivo. Las proporciones medias de la carga de ADN viral a los valores Q-PCR de DICT50 en los lotes de virus fueron similares para P17 y P19; 6,3*105 y 2,0*106 copias de ADN viral por DICT50, respectivamente. Para P21, sin embargo, la relación fue considerablemente mayor, 1,3*108 copias de ADN viral por DICT50 (Tabla 1). Por lo tanto, la medición del ADN viral en los sobrenadantes de un lote es insuficiente para asignar correctamente la infectividad de un lote y, por lo tanto, se deben realizar ensayos biológicos para determinar con precisión los títulos virales.
El coeficiente medio de variación intra-ensayo (CV) para la DICT50 Q-PCR fue del 9%, determinado por extracciones duplicadas paralelas y Q-PCR de tres placas de cultivo de DICT50. Para la DICT50 ocular, el CV intra-ensayo fue del 45%, determinado por un total de doce placas de cultivo de DICT50 leídas por dos evaluadores independientes. El CV intra-ensayo fue del 14% para la DICT50 IFA determinada por dos tinciones paralelas de células de dos series. Para el enfoque de unidades infecciosas, el CV intra-ensayo fue del 43% determinado por cuatro tinciones paralelas de células de una tirada. La media del CV interensayo fue del 73% para la DICT50 Q-PCR y del 66% para la DICT50 ocular, determinada para tres lotes de virus ejecutados cinco, tres y tres veces, respectivamente. Para la DICT50 IFA, el CV interensayo fue del 25%, determinado para un lote tres veces. Para el enfoque de unidades infecciosas, el CV interensayo fue del 77%, determinado por tres series separadas para un lote.
En resumen, el método Q-PCR TCID50 descrito aquí se correlaciona bien con la expresión de proteínas virales y, por lo tanto, tiene una alta especificidad para la dosis infecciosa. Es más robusto que la DICT50 ocular, la DICT50 IFA y el enfoque de unidades infecciosas, basado en los valores CV intra-ensayo. En este contexto, el CV intra-ensayo es una medida de cuán preciso es un determinado enfoque de lectura y, por lo tanto, es el valor más preciso para comparar los diferentes métodos. Para adaptar el método, es necesario determinar el punto de corte para cada cepa viral analizada y cada línea celular utilizada. El enfoque de lectura de Q-PCR es más laborioso que la inspección ocular, pero en nuestra opinión es considerablemente menos laborioso que el enfoque de IFA TCID50 y las unidades infecciosas. Es más caro en términos de recursos de laboratorio que la inspección ocular, el ICD50 IFA y el enfoque de unidades infecciosas. Sin embargo, nuestros datos enfatizan la importancia de realizar ensayos biológicos para determinar con precisión los títulos virales, lo que podría justificar el costo y la mano de obra. Además, una mejor estandarización de los métodos de evaluación de títulos virales utilizados en el campo del VHH-6 podría aumentar la concordancia entre los diferentes estudios.