virustitterin kontrollointi kokeellisessa työssä virusten kanssa on ratkaisevan tärkeää. Eri laboratorioissa tehtyjen tutkimusten vertailujen helpottamiseksi on suotavaa käyttää yhdenmukaistettuja standardimenetelmiä. Ihmisen herpesvirus 6 (HHV-6) on β-herpesvirus , jolle useimmat ihmiset ovat altistuneet , ja viruksen titteriarvioinnissa käytetään usein 50%: n kudosviljelmän infektoivuusannoksen (tcid50) menetelmää. Yleisesti käytetty lukuluku on silmätarkastus sytopaattisten vaikutusten (CPE) eli infektoituneiden solujen laajentumisen varalta . Yksi este tällä lähestymistavalla on, että solut voivat laajentua silloinkin, kun ne eivät ole saaneet tartuntaa. Se on erityisen vaikeaa infektion rajalla titraussarjoissa’, koska tartunnan vuoksi laajentuneet solut yleensä suurenevat vähemmän viruksen laimentuessa (Lisätiedosto 1: kuva S1). Immunofluoresenssimääritys (Ifa) on vaihtoehtoinen lukulähestymistapa silmätarkastukseen tcid50-arvioinnissa tai infektiivisten yksiköiden eli infektoituneiden solujen fraktion laskemiseen . IFA perustuu read-out on selvempi erottaa tartunnan saaneiden solujen mutta värjäys on työlästä ja huomattava määrä soluja on laskettava saada luotettavia arvoja. Yksittäisten solujen seurantaan liittyy riski, että solun positiivisuus tulkitaan väärin, mikä haittaa sekä silmien tarkastusta että IFA-pohjaisia lukemia. Siksi kehitimme ja validoimme vaihtoehtoisen tcid50: n lukulähestymistavan, jossa viruksen DNA-kuormituksen kasvu mitataan jokaisessa tcid50-viljelmälevyjen titrauskaivossa reaaliaikaisen kvantitatiivisen PCR: n (Q-PCR) avulla. Tätä lähestymistapaa verrattiin tcid50: n silmätarkastukseen ja IFA-lukemiin sekä edellä kuvattuun infektioyksiköiden lähestymistapaan.
HHV-6A (GS-kanta) levitettiin t-solulinjassa HSB-2 Glutamaxissa, joka sisälsi rpmi 1640-kasvualustaa (Invitrogen, Yhdistynyt kuningaskunta) täydennettynä 10-prosenttisella sikiöiden seerumilla (Hykloni, UT), 100 U/ml penisilliinillä ja 100 µg/ml streptomysiinillä (Invitrogeeni). Kun noin 50% elävistä soluista oli laajentunut, supernatantti otettiin talteen ja jäädytettiin välittömästi kiintiöissä -80°C: ssa analyysiin asti. Kontrolleina ohikulkevan viruksen supernatantti 17 (P17) inaktivoitiin UV-valolla 20 minuutin ajan tai lämpökäsittelyllä 56°C: ssa 1 tunnin ajan. HHV-6A: n replikaatiota HSB-2-soluissa seurattiin kymmenen päivän ajan käyttäen Q-PCR: ää (Applied Biosystems, Yhdistynyt kuningaskunta), kuten edellä on kuvattu . Ennen Q-PCR-analyysiä DNA erotettiin solususpensioista valmistajan protokollan mukaisesti 96-kuoppalevyyn perustuvalla helmipaketilla (MagMAX-96 virus RNA Isolation Kit, Applied Biosystems). Viruserän HHV-6A-DNA-pitoisuuden arvioimiseksi Q-PCR tehtiin edellä kuvatulla tavalla DNA-uuttamisen jälkeen suodatinpylväiden avulla (QIAGEN GmbH, Saksa).
tcid50-viljelmälevyjen määrittämiseksi 40 µl: n 104 HSB-2-solun solususpensiot porakaivoa kohti kylvettiin pyöreisiin 96-pohjaisiin viljelmälevyihin. Soluihin inokuloitiin 3-4 tunnin ajan 160 µl viisinkertaista HHV-6A-supernatanttilaimennosta, kuusi toistoa laimennosta kohti. Mock-ja medium-säädöt sisältyivät kolmikantaisiin kaivoihin kaikilla levyillä. Solut pestiin kerran ennen kuin jokaisesta kaivosta otettiin 50-70 µl solususpensiota ja säilytettiin -80°C: ssa nollapäivänä infektion jälkeen (dpi) otettuina näytteinä. Jäljellä olevia solususpensioita inkuboitiin seitsemän päivää 37°C: ssa. Seitsemän dpi: n kohdalla sulaneesta nollasta dpi-levystä ja seitsemästä dpi-levystä tehtiin DNA-uutto edellä kuvatun helmipohjaisen sarjan avulla. Tämän jälkeen viruksen DNA määritettiin Q-PCR-menetelmällä edellä kuvatulla tavalla.
IFA-soluissa solut kiinnitettiin lasilevyihin asetonin ja metanolin 1: 1-seoksella -20°C: ssa 10 minuutin ajan, tukittiin 5-prosenttisella vuohen seerumilla ja 3-prosenttisella BSA: lla PBS: ssä ja värjättiin HHV-6-glykoproteiinille gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD) ominaisella hiiren monoklonaalisella primaarivasta-aineella. Värjäyksen visualisoi Alexa 633 conjugated goat Anti-mouse IgG (Invitrogen). Värjäystä 4′, 6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (Vector laboratories, CA) käytettiin solun tumien visualisointiin. Peitelevyt asennettiin kiinnitysvälineillä (Dako A/S, Tanska) ja diat analysoitiin konfokaalimikroskoopilla (Leica Microsystems, Saksa). Tartunnan saaneiden solujen murto-osa määritettiin käsin laskemalla. Jos ≥1/3 soluista sisälsi virusproteiinia, laskettiin ≥25 solua kuoppaa kohti ja jos <1/3 soluista virusproteiinia, laskettiin ≥100 solua kuoppaa kohti. Kuopat, joissa ≥2% positiivisiksi värjätyistä soluista katsottiin infektoituneiksi. Viruksen DNA: n kuormituksen lisääntyminen kussakin kaivossa korreloi Ifa-värjäykseen, joka muodostaa kaavan Excel-ohjelmistoon (Microsoft, WA). Tämä kaava kysyy, onko viruksen DNA tietyssä hyvin tcid50 levy on siirtynyt tietty määrä kertoja, joka on asetettu, ja jos hyvin sama hyvin oli positiivinen IFA vai ei.
vertailussa Q-PCR-lukeman kanssa kaksi riippumatonta tarkastajaa arvioi kaikki tcid50-levyt silmätarkastuksella faasikontrastimikroskoopilla (okulaarinen tcid50). Wells katsottiin tartunnan, jos ainakin yksi laajentunut solu löytyi. Molemmille lukulähestymistavoille tcid50 laskettiin Reedin ja Muenchin kaavan mukaan .
Q-PCR: n (Q-PCR TCID50) määrittämiä tcid50-tuloksia verrattiin IFA: n (personal communication with Louis Flamand) arvioon infektioyksiköistä kolmessa P19-ja yhdessä P27-vaiheessa. Lyhyesti sanottuna 2, 5*105 HSB-2-solua inokuloitiin edellä kuvatulla tavalla erilaisilla viruksen laimennoksilla kolmikerroksisiin kuoppiin jokaista laimennosta varten. Kahden dpi: n kohdalla solut altistettiin Ifa: lle, jonka kohteena oli varhainen virusproteiini p41 (klooni 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) edellä kuvatulla tavalla. Viruksen titteri, ilmaistuna infektiivisinä yksikköinä millilitraa kohti, laskettiin kertomalla infektoituneiden solujen fraktio solujen kokonaismäärällä, jonka dpi oli nolla, ja laimennuskertoimilla.
viruksen DNA-kuormituksen lisäysmittausten optimaalisen ajankohdan määrittämiseksi viruksen replikaatiota seurattiin kymmenen päivän ajan. Viruksen DNA: n riittävään lisääntymiseen tarvittiin seitsemän päivää (Kuva 1), minkä vuoksi se valittiin sadonkorjuuajankohdaksi. Viruksen DNA: n suhteellisen lisääntymisen leikkauspisteen määrittämiseksi positiiviseen infektioon nähden viruksen DNA: n kuormituksen lisäys korreloi viruksen proteiiniekspression kanssa. IFA tehtiin seitsemällä dpi: llä jokaisen kaivon soluille kolmessa tcid50-levyssä kahta eri viruserää varten. Optimaaliseksi leikkauspisteeksi todettiin viruksen DNA: n kymmenkertaistuminen, jossa korrelaatio proteiinin ilmentymiseen havaittiin 93%: ssa kuopoista (kuva 2).
HHV-6A: n (GS-kanta) replikaatio, jota seuraa Q-PCR. Esitetyt tiedot ovat keskiarvotuloksia (±sem) kolmikantaviljelmistä jokaista infektiokertaa kohti (MOI). Yhdysjohdot katkeavat, kun viruksen DNA-kuormitus laskee havaitsemisrajan alle.
infektion leikkauspisteen määrittäminen. Optimaaliseksi cut-pisteeksi infektiolle todettiin kymmenkertaistuminen, jossa IFA: n havaittiin korreloivan proteiinin ilmentymiseen 93%: ssa kuovista vasta-aineella, joka kohdistui myöhäiseen virusproteiiniin gp116/54/64. Mikään kaivo ei sisältänyt virusproteiinia, jossa viruksen DNA-kuormitus ei ollut kymmenkertaistunut. Esitetyt tiedot ovat keskiarvotuloksia (±sem) kolmelta tcid50-levyltä.
vertaamalla Q-PCR TCID50: n arvoja silmään ja IFA TCID50: een, yksi Q-PCR tcid50 oli 1, 41 silmään ja 1, 03 Ifa TCID50: een perustuen 13 tai 5 arviointiin. Q-PCR TCID50 ei antanut tilastollisesti erilaisia arvoja verrattuna silmään tai IFA tcid50: een (P = 0, 41 tai P = 0, 29) (paritettu t-testi) (Taulukko 1).
viruksen DNA: n kopiolukuja käytetään usein karkeana arviona tietyn viruserän sisältämien virushiukkasten määrästä. On kuitenkin epävarmaa, kuinka hyvin tämä vastaa infektiivisyyttä. Tämän arvioimiseksi TCID50-arvoja verrattiin vastaavan erän viruksen DNA-kopionumeroihin. Viruksen DNA-kuormituksen ja Q-PCR: n tcid50-arvojen keskimääräiset suhteet viruserissä olivat samanlaiset P17: llä ja P19: llä; 6, 3*105 ja 2, 0*106 viruksen DNA-kopiota tcid50: tä kohti. P21: llä suhde oli kuitenkin huomattavasti suurempi, 1, 3*108 viruksen DNA-kopiota per tcid50 (Taulukko 1). Näin ollen viruksen DNA: n mittaaminen erän supernatanteista ei riitä osoittamaan erän infektiivisyyttä oikein, ja siksi olisi tehtävä biologisia määrityksiä, jotta viruksen titterit voidaan määrittää tarkasti.
keskimääräinen määrityksen sisäinen variaatiokerroin (CV) Q-PCR TCID50: lle oli 9%, joka määritettiin kolmen tcid50-viljelmälevyn rinnakkaisilla kaksoiskappaleilla ja Q-PCR: llä. Silmän TCID50: n intra-määrityksen CV oli 45%, joka määritettiin kahdellatoista tcid50-viljelmälevyllä, jotka kaksi riippumatonta arvioijaa luki. Ifa TCID50: n sisäinen CV oli 14% määritettynä kahdella rinnakkaisella soluvärjäyksellä kahdesta testikerrasta. Tartuntayksiköiden osalta intra-määrityksen CV oli 43%, joka määritettiin yhdellä testikerralla tehdyllä neljällä rinnakkaisella soluvärjäyksellä. Keskimääräinen Inter-assay CV oli 73% Q-PCR TCID50: llä ja 66% okulaarisella tcid50: llä, joka määritettiin kolmessa viruserässä, jotka suoritetaan viisi, kolme ja kolme kertaa. Ifa TCID50: n osalta inter-assay CV oli 25%, joka määritettiin yhdellä eräajolla kolme kertaa. Tartuntayksiköiden lähestyessä inter-assay CV oli 77%, joka määritettiin kolmella erillisellä testillä yhtä erää kohti.
yhteenvetona voidaan todeta, että tässä kuvattu Q-PCR TCID50-menetelmä korreloi hyvin virusproteiinien ilmentymisen kanssa ja on siten erittäin spesifinen infektioannokselle. Se on kestävämpi kuin silmän TCID50, Ifa TCID50 ja infektiivisten yksiköiden lähestymistapa, joka perustuu määrityksen sisäisiin CV-arvoihin. Intra-assay CV on tässä määrityksessä mitta siitä, kuinka tarkka tietty read-out-lähestymistapa on, ja on siten tarkin arvo eri menetelmien vertailulle. Menetelmän mukauttamiseksi leikkauspiste on määritettävä jokaiselle testatulle viruskannalle ja jokaiselle käytetylle solulinjalle. Q-PCR-lukulähestymistapa on työläämpi kuin silmätarkastus, mutta mielestämme huomattavasti vähemmän työläs kuin IFA TCID50 ja infektioyksiköiden lähestymistapa. Se on laboratorioresurssien kannalta kalliimpaa kuin silmätarkastus, IFA TCID50 ja infektioyksiköiden lähestymistapa. Kuitenkin meidän tiedot korostavat, että on tärkeää suorittaa biologisia määrityksiä tarkasti määrittää virus-tiitterit, mikä saattaa edellyttää kustannuksia ja työvoimaa. Lisäksi HHV-6-kentässä käytettyjen virustitterin arviointimenetelmien parempi standardointi saattaa lisätä eri tutkimusten vastaavuutta.