electroforeza în Gel ADN este o tehnică utilizată pentru separarea și identificarea fragmentelor de ADN în funcție de dimensiune.
fragmente de ADN de diferite dimensiuni sunt încărcate într – un gel poros obținut din agaroză-un carbohidrat găsit în algele roșii.
când se aplică un câmp electric, fragmentele vor migra prin gel, datorită grupărilor fosfat încărcate negativ din nucleotidele ADN.
bucăți mai mici de ADN vor migra mai ușor prin gel decât fragmente mai mari, care au un timp mai dificil de mișcare prin matricea gelului.
când rularea gelului este completă, locația probelor de ADN poate fi comparată cu o serie de fragmente sau benzi de dimensiuni cunoscute, numite scară ADN.
prezența fragmentului dvs. de interes poate fi apoi confirmată pe baza dimensiunii sale, care este determinată prin compararea locației relative a eșantionului dvs. de testare cu fragmentele scării.
gelurile de agaroză sunt preparate folosind o soluție procentuală greutate peste volum. Deci, 1 gram de agaroză în 100 ml de tampon va face un gel de 1%. Gelurile cu procent mai mic vor rezolva mai bine fragmentele mai mari, iar gelurile cu procent mai mare vor face fragmentele mai mici mai ușor de identificat. Pentru a începe procedura de fabricare a gelului, cântăriți masa corespunzătoare de agaroză într-un balon Erlenmeyer.
adăugați tampon de funcționare în balon, astfel încât volumul tamponului să nu fie mai mare de 1/3 din capacitatea balonului. Apoi rotiți pentru a amesteca.
topiți amestecul de agaroză/tampon încălzind într-un cuptor cu microunde la putere maximă. La fiecare treizeci de secunde, scoateți balonul și rotiți conținutul pentru a se amesteca bine. Repetați până când agaroza s-a dizolvat complet.
apoi se adaugă bromura de etidiu la o concentrație de 0,5 mg/ml. Bromura de etidiu este un compus aromatic care se potrivește între perechi de baze individuale de ADN sau intercalate și determină ADN-ul să emită fluorescență portocalie intensă sub lumină UV. Este important să rețineți că bromura de etidiu este cancerigenă, astfel încât mănușile trebuie purtate întotdeauna la manipularea gelurilor care conțin acest compus.
pentru a preveni deformarea tăvii de gel, lăsați agaroza să se răcească plasând-o într-o baie de apă de 65 de CENTICLI.
pe măsură ce agaroza se răcește, pregătiți matrița de gel prin plasarea tăvii de gel în aparatul de turnare. Ca alternativă, puteți utiliza bandă pentru a sigila marginile deschise ale tăvii de gel pentru a crea matrița. Plasarea unui pieptene în gel creează puțurile în care este încărcat ADN-ul. Asigurați-vă că pieptenele vor crea un puț care are dimensiunea potrivită pentru proba dvs. de ADN.
se toarnă agaroza topită în matrița de gel și se lasă să se întărească la temperatura camerei.
după ce agaroza s-a întărit, scoateți pieptenele. Dacă gelul nu va fi utilizat imediat, înfășurați-l în folie de plastic și păstrați-l la 4 CENTICC până la utilizare.
dacă gelul va fi utilizat imediat, puneți-l în cutia cu gel.
pentru a începe această procedură, adăugați colorant de încărcare a gelului la probele de ADN care urmează să fie separate. Încărcarea colorantului se face de obicei la o concentrație de 6x. Încărcarea colorantului ajută la vizualizarea și încărcarea probelor în puțuri și ajută la determinarea cât de departe au migrat probele în timpul rulării.
setați sursa de alimentare la tensiunea dorită.
Acum adăugați suficient tampon de rulare în cutia de gel pentru a acoperi suprafața gelului. Asigurați-vă că utilizați același tampon de rulare ca cel folosit pentru prepararea gelului.
conectați cablurile cutiei de gel la sursa de alimentare și porniți-o. Amintiți-vă că ADN-ul este încărcat negativ și se va deplasa spre anod, care este pozitiv și, în general, de culoare roșie. Asigurați-vă că nu conectați cablul negru sau catodul la partea inferioară a cutiei de gel. Deci, nu uitați, rețineți că pisicile negre sunt ghinion sau negative, iar catodul negru este, prin urmare, negativ. Rulați gelul la roșu sau la anod. Pentru a verifica dacă atât cutia de gel, cât și sursa de alimentare funcționează; apariția bulelor la electrozi indică faptul că trece curentul.
scoateți capacul cutiei de gel. Încărcați încet și cu atenție probele de ADN în gel. Din nou, colorantul de încărcare din eșantion permite eșantionului să se scufunde în gel și va ajuta la urmărirea cât de departe a parcurs eșantionul. Un marker de dimensiune ADN sau o scară trebuie întotdeauna încărcat împreună cu probele experimentale.
puneți la loc capacul. Verificați de două ori dacă electrozii sunt conectați la sloturile corecte din sursa de alimentare.
porniți alimentarea. Rulați gelul până când colorantul a migrat la o distanță adecvată.
când electroforeza este completă, opriți sursa de alimentare și scoateți capacul cutiei de gel.
scoateți gelul din cutia de gel și scurgeți excesul de tampon de pe suprafața gelului. Așezați tava cu gel pe prosoape de hârtie pentru a absorbi orice tampon de funcționare rămas.
pentru a vizualiza fragmentele de ADN, scoateți gelul din tava de gel și expuneți gelul la lumină ultravioletă.
fragmentul de ADN ar trebui să apară ca benzi fluorescente portocalii. Faceți o fotografie a gelului.
la sfârșitul experimentului, eliminați în mod corespunzător gelul și tamponul de funcționare conform reglementărilor instituției. Din nou, nu uitați să manipulați întotdeauna gelul și tampoanele de rulare cu mănuși pentru a evita expunerea la bromură de etidiu.
acum că ați văzut cum să efectuați electroforeza cu gel ADN. Să aruncăm o privire la unele aplicații în aval și variații ale acestei metode extrem de utile.
aici vedeți un rezultat de electroforeză în gel de agaroză după separarea produselor PCR. Fragmentele de ADN încărcate în gel sunt vizibile ca benzi clar definite. Standardul ADN sau scara trebuie separate într-o măsură care să permită determinarea utilă a dimensiunilor benzilor de probă. În acest exemplu, fragmente de ADN de 765 perechi de baze, 880 perechi de baze și 1022 perechi de baze sunt separate pe un gel de agaroză de 1,5% cu o scară de ADN cu 2 bușteni.
pe lângă confirmarea prezenței unui fragment de ADN de interes, electroforeza în gel ADN poate fi combinată cu proceduri de purificare a gelului. De obicei, o lamă de ras este utilizată pentru a tăia fragmentul de ADN de interes, astfel încât să poată fi colectat și proba de ADN din acesta recuperată.
electrofeza gelului de agaroză poate fi, de asemenea, combinată cu transfer blotting, care implică permiterea ADN-ului sau ARN-ului să se transfere într-o membrană de celuloză, unde sondele radioactive pot fi utilizate pentru a identifica secvențe specifice de ADN sau ARN în proba dvs. separată electroforetic.
electroforeza cu gel ADN standard nu este ideală pentru separarea ADN-ului cu greutate moleculară mare mai mare de 15-20 kb, cum ar fi ADN-ul genomic. Pentru a separa probele mari de ADN, se utilizează electroforeza cu gel de câmp pulsatoriu, care implică supunerea gelului la un câmp electric în schimbare sau pulsatoriu în direcții diferite. Această tehnică implică un aparat specializat de rulare a gelului, care are perechi de electrozi îmbrăcați în diferite orientări în jurul gelului. Acest lucru poate fi folosit pentru a detecta diferențele în dimensiunile genomului între populațiile de organisme, cum ar fi probele de ADN adunate din diferite comunități microbiene, vedeți aici care sunt luate din medii diferite ale lacurilor.
tocmai ați văzut o introducere în electroforeza cu gel ADN. V-am arătat conceptul din spatele metodei, cum să preparați gelul de agaroză, cum să încărcați probele, cum să rulați gelul și să îl analizați și câteva aplicații comune ale electroforezei gelului de agaroză. Vă mulțumim pentru vizionarea și noroc cu rularea gel.