DNA-Geelielektroforeesi on tekniikka, jota käytetään DNA-fragmenttien erottamiseen ja tunnistamiseen koon perusteella.
erikokoiset DNA-fragmentit Ladataan huokoiseen geeliin, joka on valmistettu agaroosista – hiilihydraatista, jota esiintyy punalevissä.
sähkökentässä fragmentit siirtyvät geelin läpi DNA-nukleotidien negatiivisesti varautuneiden fosfaattiryhmien ansiosta.
pienemmät DNA-kappaleet siirtyvät helpommin geelin läpi kuin suuremmat fragmentit, joiden on vaikeampi liikkua geelimatriisin läpi.
kun geelijuoksu on valmis, DNA-näytteidesi sijaintia voidaan verrata tunnettujen kokoisten fragmenttien tai kaistaleiden sarjaan, jota kutsutaan DNA-tikapuiksi.
kiinnostavan sirpaleen olemassaolo voidaan sitten vahvistaa sen koon perusteella, joka määritetään vertaamalla testinäytteesi suhteellista sijaintia tikkaiden sirpaleisiin.
Agaroosigeelit valmistetaan käyttämällä tilavuusprosenttiliuosta. Joten 1 gramma agaroosia 100 ml: ssa puskuria tekee 1% geelistä. Pienempi prosentti geelit paremmin ratkaista suurempia fragmentit ja korkeampi prosentti geelit tekevät pienempiä fragmentit helpompi tunnistaa. Geelinvalmistus aloitetaan punnitsemalla sopiva agaroosimassa erlenmeyerkolviin.
lisätään juokseva puskuri pulloon siten, että puskurin tilavuus on enintään 1/3 pullon tilavuudesta. Sekoita sitten pyörittelemällä.
Agaroosi/puskuriseos sulatetaan kuumentamalla mikrossa maksimiteholla. Pullosta otetaan 30 sekunnin välein pulloja, jotka sekoittuvat hyvin. Toista kunnes agaroosi on täysin liuennut.
lisätään seuraavaksi etidiumbromidia pitoisuuteen 0, 5 mg / ml. Etidiumbromidi on aromaattinen yhdiste, joka sopii DNA: n yksittäisten emäsparien eli interkalaattien väliin ja saa DNA: n säteilemään voimakasta oranssia fluoresenssia UV-valossa. On tärkeää huomata, että etidiumbromidi on karsinogeeni, joten käsineitä on aina käytettävä käsiteltäessä tätä yhdistettä sisältäviä geelejä.
agaroosin annetaan jäähtyä 65ºc: n vesihauteessa, jotta geelialusta ei vääntyisi.
agaroosin jäähtyessä valmistetaan geelimuotti asettamalla geelitarjotin valulaitteeseen. Vaihtoehtoisesti voit käyttää teippiä geelilokeron avoimien reunojen tiivistämiseen muotin luomiseksi. Kamman asettaminen geeliin luo kaivot, joihin DNA: ta Ladataan. Varmista, että kammasta syntyy DNA-näytteellesi sopivan kokoinen kaivo.
kaada sula agaroosi geelimuottiin ja anna sen kovettua huoneenlämmössä.
kun agaroosi on kovettunut, ota kampa pois. Jos geeliä ei käytetä heti, kääri se muovikelmuun ja säilytä 4 ° C: ssa, kunnes käytät sitä.
jos geeli on tarkoitus käyttää välittömästi, laita se geelilaatikkoon.
tämän toimenpiteen aloittamiseksi lisätään erotettaviin DNA-näytteisiin geelimäistä väriainetta. Kuormitusväri tehdään tyypillisesti 6X-pitoisuudella. Väriaineen lataaminen auttaa visualisoimaan ja lataamaan näytteitä kaivoihin ja auttaa määrittämään, kuinka pitkälle näytteet ovat kulkeutuneet ajon aikana.
Aseta virtalähde halutulle jännitteelle.
lisää nyt geelilaatikkoon sen verran juoksevaa puskuria, että geelin pinta peittyy. Varmista, että käytät samaa juoksevaa puskuria, jota käytetään geelin valmistukseen.
Liitä geelilaatikon johdot virtalähteeseen ja käynnistä se. Muista, että DNA on negatiivisesti varautunut ja siirtyy kohti anodia, joka on positiivinen ja yleensä punainen. Varmista, ettet yhdistä mustaa lyijyä tai katodia geelilaatikon pohjaan. Joten et unohda, pitää mielessä, että mustat kissat ovat huonoa onnea, tai negatiivinen, ja musta katodi on siis negatiivinen. Aja geeli punaiselle tai anodille. Tarkistaa, että sekä geelilaatikko että virtalähde toimivat; kuplien ulkonäkö elektrodeissa osoittaa, että virta kulkee läpi.
Poista geelilaatikon kansi. Lataa DNA-näytteet geeliin hitaasti ja huolellisesti. Jälleen näytteen kuormitusväri mahdollistaa näytteen uppoamisen geeliin ja auttaa seuraamaan, kuinka pitkälle näyte on kulkenut. Koenäytteiden mukana tulee aina ladata DNA-kokomerkki eli tikapuut.
Vaihda kansi. Tarkista kahdesti, että elektrodit on kytketty virtalähteen oikeisiin aukkoihin.
kytke virta päälle. Aja geeliä, kunnes väriaine on siirtynyt sopivalle etäisyydelle.
kun elektroforeesi on suoritettu, sammuta virtalähde ja poista geelilaatikon kansi.
poista geeli geelilaatikosta ja valuta ylimääräinen puskuri pois geelin pinnalta. Aseta geelialusta talouspaperille imemään jäljellä oleva juokseva puskuri.
DNA-fragmenttien visualisoimiseksi geeli poistetaan geelialustalta ja asetetaan ultraviolettivalolle.
DNA-fragmenttien tulisi näkyä oransseina fluoresoivina kaistoina. Ota kuva geelistä.
kokeen lopussa geeli ja puskuri on hävitettävä asianmukaisesti laitoksen säännösten mukaisesti. Muista aina käsitellä geeliä ja juoksevia puskureita käsineillä etidiumbromidialtistuksen välttämiseksi.
nyt kun olet nähnyt, miten DNA-geelielektroforeesi tehdään. Katsotaanpa katsomaan joitakin loppupään sovelluksia ja muunnelmia tämän erittäin hyödyllinen menetelmä.
tässä on agaroosigeelielektroforeesitulos PCR-tuotteiden erottamisen jälkeen. Geeliin ladatut DNA-fragmentit näkyvät selvästi määriteltyinä kaistoina. DNA-standardi tai-tikkaat olisi erotettava toisistaan niin, että näytekaistojen koot voidaan määrittää hyödyllisesti. Tässä esimerkissä 765 emäsparin, 880 emäsparin ja 1022 emäsparin DNA-fragmentit erotetaan toisistaan 1,5-prosenttisella agaroosigeelillä 2-log-DNA-tikapuilla.
kiinnostavan DNA-fragmentin esiintymisen varmistamisen lisäksi DNA-geelielektroforeesi voidaan yhdistää geelin puhdistusmenetelmiin. Tyypillisesti partaterällä leikataan kiinnostava DNA-pätkä pois, jotta se voidaan kerätä ja sen sisällä oleva DNA-näyte ottaa talteen.
Agaroosigeelielektrofeesi voidaan myös yhdistää transfer blottaukseen, jossa DNA: n eli RNA: n annetaan siirtyä selluloosakalvoon, jossa radioaktiivisilla koettimilla voidaan tunnistaa tietyt DNA-tai RNA-sekvenssit elektroforeettisesti erotetussa näytteessä.
standardi DNA-geelielektroforeesi ei ole ihanteellinen suurimolekyylisen, yli 15-20 kb: n kokoisen DNA: n erottamiseen, kuten genominen DNA. Suurten DNA-näytteiden erottamiseen käytetään pulssikenttägeelielektroforeesia, jossa geeli altistetaan muuttuvalle eli sykkivälle sähkökentälle eri suuntiin. Tämä tekniikka liittyy erikoistunut geeli käynnissä laite, joka on paria elektrodeja arrayed eri suunnissa ympäri geeli. Tämän avulla voidaan havaita eroja eliöpopulaatioiden genomikooissa, kuten eri mikrobiyhteisöjen yhdistetyt DNA-näytteet, jotka on otettu eri järviympäristöistä.
olet juuri nähnyt johdannon DNA – geelielektroforeesille. Näytimme menetelmän takana olevan konseptin, miten agaroosigeeli valmistetaan, miten näytteet Ladataan, miten geeli suoritetaan ja analysoidaan ja joitakin agaroosigeelielektroforeesin yleisiä sovelluksia. Kiitos katselusta ja onnea geelin kanssa.