L’électrophorèse sur gel d’ADN est une technique utilisée pour séparer et identifier les fragments d’ADN en fonction de leur taille.
Des fragments d’ADN de différentes tailles sont chargés dans un gel poreux à base d’agarose – un glucide présent dans les algues rouges.
Lorsqu’un champ électrique est appliqué, les fragments migrent à travers le gel, grâce aux groupes phosphates chargés négativement dans les nucléotides d’ADN.
Des morceaux d’ADN plus petits migrent plus facilement à travers le gel que des fragments plus gros, qui ont plus de difficulté à se déplacer à travers la matrice du gel.
Lorsque le cycle de gel est terminé, l’emplacement de vos échantillons d’ADN peut être comparé à une série de fragments ou de bandes de tailles connues, appelée échelle d’ADN.
La présence de votre fragment d’intérêt peut ensuite être confirmée en fonction de sa taille, qui est déterminée en comparant l’emplacement relatif de votre échantillon de test aux fragments de l’échelle.
Les gels d’agarose sont préparés à l’aide d’une solution de pourcentage en poids sur volume. Ainsi, 1 gramme d’agarose dans 100 ml de tampon fera un gel à 1%. Des gels à pourcentage inférieur résoudront mieux les fragments plus gros et des gels à pourcentage plus élevé faciliteront l’identification des fragments plus petits. Pour commencer la procédure de fabrication du gel, pesez la masse appropriée d’agarose dans un flacon Erlenmeyer.
Ajouter du tampon courant dans le flacon, de sorte que le volume du tampon ne dépasse pas 1/3 de la capacité du flacon. Puis tourbillonnez pour mélanger.
Faire fondre le mélange agarose/tampon en chauffant au micro-ondes à puissance maximale. Toutes les trente secondes, retirez le flacon et faites tourbillonner le contenu pour bien mélanger. Répétez jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissous.
Ajouter ensuite le bromure d’éthidium à une concentration de 0,5 mg / ml. Le bromure d’éthidium est un composé aromatique qui s’insère entre des paires de bases individuelles d’ADN, ou intercalés, et provoque l’émission d’une fluorescence orange intense sous la lumière UV. Il est important de noter que le bromure d’éthidium est un agent cancérigène, de sorte que des gants doivent toujours être portés lors de la manipulation de gels contenant ce composé.
Pour éviter que le plateau de gel ne se déforme, laissez refroidir l’agarose en le plaçant dans un bain-marie à 65ºC.
Pendant que l’agarose se refroidit, préparez le moule en gel en plaçant le plateau à gel dans l’appareil de coulée. Comme alternative, vous pouvez utiliser du ruban adhésif pour sceller les bords ouverts du plateau de gel pour créer le moule. Placer un peigne dans le gel crée les puits où l’ADN est chargé. Assurez-vous que le peigne créera un puits de la taille appropriée pour votre échantillon d’ADN.
Versez l’agarose fondu dans le moule en gel et laissez-le durcir à température ambiante.
Une fois l’agarose durci, retirez le peigne. Si le gel ne doit pas être utilisé immédiatement, enveloppez-le dans une pellicule plastique et conservez-le à 4ºC jusqu’à utilisation.
Si le gel doit être utilisé immédiatement, placez-le dans la boîte à gel.
Pour commencer cette procédure, ajoutez un colorant chargé en gel aux échantillons d’ADN à séparer. Le colorant de chargement est généralement fabriqué à une concentration de 6X. Le chargement du colorant aide à visualiser et à charger les échantillons dans les puits et aide à déterminer dans quelle mesure les échantillons ont migré pendant l’exécution.
Réglez l’alimentation sur la tension souhaitée.
Ajoutez maintenant suffisamment de tampon de course dans la boîte à gel pour couvrir la surface du gel. Assurez-vous d’utiliser le même tampon de course que celui utilisé pour préparer le gel.
Connectez les fils de la boîte à gel à l’alimentation et allumez-la. Rappelez-vous que l’ADN est chargé négativement et se déplacera vers l’anode, qui est positive et généralement de couleur rouge. Assurez-vous de ne pas connecter le fil noir, ou la cathode, au fond de la boîte à gel. Alors n’oubliez pas, gardez à l’esprit que les chats noirs sont malchanceux, ou négatifs, et que la CAThode noire est donc négative. Passez votre gel au rouge, ou l’anode. Pour vérifier que la boîte à gel et l’alimentation fonctionnent; l’apparition de bulles au niveau des électrodes indique que du courant passe.
Retirez le couvercle de la boîte à gel. Chargez lentement et soigneusement les échantillons d’ADN dans le gel. Encore une fois, le colorant de chargement dans l’échantillon permet à l’échantillon de s’enfoncer dans le gel et aidera à suivre la distance parcourue par l’échantillon. Un marqueur de taille d’ADN, ou échelle, doit toujours être chargé avec les échantillons expérimentaux.
Remplacer le couvercle. Vérifiez que les électrodes sont branchées dans les fentes correctes de l’alimentation.
Allumez l’appareil. Exécutez le gel jusqu’à ce que le colorant ait migré à une distance appropriée.
Lorsque l’électrophorèse est terminée, coupez l’alimentation électrique et retirez le couvercle de la boîte à gel.
Retirez le gel de la boîte à gel et égouttez l’excès de tampon à la surface du gel. Placez le bac à gel sur du papier absorbant pour absorber tout tampon restant.
Pour visualiser les fragments d’ADN, retirez le gel du plateau de gel et exposez le gel à la lumière ultraviolette.
Le fragment d’ADN doit apparaître sous forme de bandes fluorescentes orange. Prenez une photo du gel.
À la fin de l’expérience, éliminer correctement le gel et le tampon de fonctionnement selon les règlements de l’établissement. Encore une fois, n’oubliez pas de toujours manipuler le gel et les tampons en cours d’exécution avec des gants pour éviter l’exposition au bromure d’éthidium.
Maintenant que vous avez vu comment effectuer une électrophorèse sur gel d’ADN. Jetons un coup d’œil à certaines applications et variantes en aval de cette méthode très utile.
Ici, vous voyez un résultat d’électrophorèse sur gel d’agarose après séparation des produits de PCR. Les fragments d’ADN chargés dans le gel sont visibles sous forme de bandes clairement définies. L’étalon ou l’échelle d’ADN doit être séparé de manière à permettre la détermination utile de la taille des bandes d’échantillons. Dans cet example, des fragments d’ADN de 765 paires de bases, 880 paires de bases et 1022 paires de bases sont séparés sur un gel d’agarose à 1,5% avec une échelle d’ADN à 2 log.
En plus de confirmer la présence d’un fragment d’ADN d’intérêt, l’électrophorèse sur gel d’ADN peut être combinée avec des procédures de purification sur gel. Typiquement, une lame de rasoir est utilisée pour découper le fragment d’ADN d’intérêt, de sorte qu’il puisse être collecté et que l’échantillon d’ADN qu’il contient soit récupéré.
L’électrophèse sur gel d’agarose peut également être combinée à un transfert par transfert, qui consiste à permettre à l’ADN, ou à l’ARN, de se transférer sur une membrane de cellulose où des sondes radioactives peuvent être utilisées pour identifier des séquences d’ADN ou d’ARN spécifiques dans votre échantillon séparé électrophorétiquement.
L’électrophorèse sur gel d’ADN standard n’est pas idéale pour la séparation d’ADN de poids moléculaire élevé supérieur à 15-20 kb, comme l’ADN génomique. Pour séparer de gros échantillons d’ADN, on utilise une électrophorèse sur gel à champ pulsé, qui consiste à soumettre le gel à un champ électrique changeant ou pulsant dans différentes directions. Cette technique implique un appareil de course de gel spécialisé, qui comporte des paires d’électrodes disposées dans différentes orientations autour du gel. Cela peut être utilisé pour détecter les différences de taille de génome entre les populations d’organismes, comme les échantillons d’ADN regroupés de différentes communautés microbiennes, que vous voyez ici, qui sont prélevés dans différents environnements lacustres.
Vous venez de voir une introduction à l’électrophorèse sur gel d’ADN. Nous vous avons montré le concept de la méthode, comment préparer le gel d’agarose, comment charger vos échantillons, comment exécuter le gel et l’analyser ainsi que certaines applications courantes de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec l’exécution de votre gel.