a electroforese em gel de ADN é uma técnica utilizada para separar e identificar fragmentos de ADN com base no tamanho.
fragmentos de ADN de várias dimensões são carregados num gel poroso feito de agarose – um hidrato de carbono encontrado em algas vermelhas.
quando um campo elétrico é aplicado, os fragmentos migram através do gel, graças aos grupos de fosfato carregados negativamente nos nucleótidos de DNA.
pedaços menores de DNA migram mais facilmente através do gel do que fragmentos maiores, que têm um tempo mais difícil de se mover através da matriz do gel.
quando o teste do gel estiver completo, a localização das suas amostras de ADN pode ser comparada a uma série de fragmentos ou bandas de tamanhos conhecidos, chamados de escada do ADN.
a presença do seu fragmento de interesse pode então ser confirmada com base no seu tamanho, que é determinado comparando a localização relativa da sua amostra de teste com os fragmentos da escada.
Agarose gels são preparados utilizando uma solução em percentagem de peso superior ao volume. Assim, 1 grama de agarose em 100 ml de tampão fará um gel a 1%. Menor porcentagem de géis resolverá melhor fragmentos maiores e maior porcentagem de géis tornará fragmentos menores mais fáceis de identificar. Para iniciar o processo de fabrico do gel, pesar a massa adequada de agarose num Erlenmeyer.Adicionar tampão de correr ao balão
, de modo a que o volume do tampão não seja superior a 1/3 da capacidade do balão. Em seguida, Girar para misturar.
derreter a mistura de agarose / tampão por aquecimento num microondas com potência máxima. A cada trinta segundos, retire o frasco e rode o conteúdo para misturar bem. Repetir até a agarose estar completamente dissolvida.Adicionar de seguida brometo de etídio a uma concentração de 0, 5 mg/ml . Brometo de etídio é um composto aromático que se encaixa entre pares de base individuais de DNA, ou intercalatos, e faz com que o DNA emite fluorescência laranja intensa sob a luz UV. É importante notar que o brometo de etídio é cancerígeno, pelo que as luvas devem ser sempre utilizadas ao manusear géis que contenham este composto.
para evitar que o tabuleiro do gel afunde, deixe arrefecer a agarose, colocando-a num banho de água de 65ºC.
à medida que a agarose arrefece, preparar o molde do gel, colocando o tabuleiro do gel no aparelho de fundição. Como alternativa, você pode usar fita para selar as bordas abertas da bandeja de gel para criar o molde. Colocar um pente no gel cria os poços onde o DNA é carregado. Certifique-se de que o pente irá criar um poço que é o tamanho apropriado para a sua amostra de DNA.
verter a agarose fundida para o molde do gel e permitir-lhe endurecer à temperatura ambiente.
depois de endurecida a agarose, retire o pente. Se o gel não for utilizado imediatamente, enrole-o em película aderente e guarde-o a 4ºC até ser utilizado.
se o gel for utilizado imediatamente, coloque-o na caixa de gel.
para iniciar este procedimento, adicione corante de carga de gel às amostras de ADN a separar. O corante de carga é tipicamente feito a uma concentração de 6X. O corante de carga ajuda a visualizar e carregar amostras para os poços e ajuda a determinar até onde as amostras migraram durante a execução.
ajustar a fonte de alimentação à tensão desejada.
adicione agora um tampão de correr suficiente na caixa de gel para cobrir a superfície do gel. Certifique-se de usar o mesmo buffer de execução que o usado para preparar o gel.
ligar os cabos da caixa de gel à fonte de alimentação e ligá-la. Lembre-se que o DNA é carregado negativamente e vai se mover em direção ao ânodo, que é positivo, e geralmente vermelho na cor. Certifique-se de não conectar o chumbo preto, ou cátodo, ao fundo da caixa de gel. Então você não se esqueça, tenha em mente que os gatos negros são má sorte, ou negativo, e o cátodo Negro é, portanto, negativo. Passa o gel para vermelho, ou para o ânodo. Para verificar se a caixa de gel e a fonte de alimentação estão funcionando, o aparecimento de bolhas nos eletrodos indica que a corrente está passando. Retire a tampa da caixa de gel . Coloque lenta e cuidadosamente as amostras de ADN no gel. Novamente, o corante de carga na amostra permite que a amostra para afundar no gel e vai ajudar a rastrear até onde a amostra viajou. Um marcador de tamanho de DNA, ou escada, deve ser sempre carregado junto com as amostras experimentais.Substitua a tampa. Verifique novamente se os eletrodos estão conectados às fendas corretas na fonte de alimentação.
ligar a energia. Execute o gel até que o corante tenha migrado para uma distância apropriada.
quando a electroforese terminar, desligue a fonte de alimentação e retire a tampa da caixa de gel.
retire o gel da caixa de gel e esvazie o tampão em excesso na superfície do gel. Coloque o tabuleiro de gel em toalhas de papel para absorver qualquer tampão de correr restante.
para visualizar os fragmentos de ADN, remover o gel do tabuleiro do gel e expor o gel à luz ultra violeta.
o fragmento de ADN deve aparecer como bandas fluorescentes laranja. Tira uma foto do gel.
no final da experiência, eliminar adequadamente o gel e o tampão de correr por Regulamento institucional. Mais uma vez, lembre-se de manipular sempre o gel e tampões de correr com luvas para evitar a exposição ao brometo de etídio.
agora que já viu como executar a electroforese em gel de ADN. Vamos dar uma olhada em algumas aplicações a jusante e variações deste método altamente útil.
aqui pode ver um resultado da electroforese em gel de agarose após a separação dos produtos PCR. Os fragmentos de ADN carregados no gel são visíveis como faixas claramente definidas. O padrão ou escada de DNA deve ser separado a um grau que permita a determinação útil dos tamanhos das bandas de amostra. Neste exemplo, fragmentos de DNA de 765 pares de base, 880 pares de base e 1022 pares de base são separados em um gel de agarose de 1,5% com uma escada de DNA de 2 log.
para além de confirmar a presença de um fragmento de ADN relevante, a electroforese em gel de ADN pode ser combinada com procedimentos de purificação do gel. Normalmente uma lâmina de barbear é usada para cortar o fragmento de DNA de interesse, de modo que ele pode ser coletado e a amostra de DNA dentro dele recuperado.
a electrofese em gel de Agarose também pode ser combinada com a coagulação por transferência, que envolve a transferência do ADN, ou ARN, para uma membrana da celulose onde podem ser utilizadas sondas radioactivas para identificar sequências específicas de ADN ou ARN na sua amostra separada electroforeticamente.
a electroforese padrão em gel de ADN não é ideal para a separação do ADN de elevado peso molecular de tamanho superior a 15-20 kb, como o ADN genómico. Para separar grandes amostras de DNA, eletroforese de campo de pulso é usado, o que envolve submeter o gel a um campo elétrico em diferentes direções. Esta técnica envolve um aparelho de execução de gel especializado, que tem pares de eletrodos dispostos em diferentes orientações em torno do gel. Isto pode ser usado para detectar diferenças no tamanho do genoma entre populações de organismos, como as amostras de DNA agrupadas de diferentes comunidades microbianas, você vê aqui que são tomadas de diferentes ambientes lacustres.Acabou de ver uma introdução à electroforese em gel de ADN. Nós mostramos-lhe o conceito por trás do método, como preparar o gel de agarose, como carregar suas amostras, como executar o gel, e analisá-lo e algumas aplicações comuns de electroforese em gel de agarose. Obrigado por assistir e boa sorte com o seu gel.