El aislamiento y la expansión a largo plazo de las células primarias, en particular las poblaciones madre/progenitora, son técnicas básicas fundamentales e importantes en varios campos biológicos, incluida la biología del desarrollo y la biología de células madre, y la ciencia médica. Las células en tejidos epiteliales estratificados y columnares son altamente regenerativas y responsables desproporcionadamente de muchos cánceres humanos; sin embargo, la clonación de células madre adultas está limitada por las dificultades para mantener estas células en un estado inmaduro. En los últimos años, las innovaciones técnicas han dado lugar a un progreso rápido y dramático en la biología de las células madre, como el uso de moléculas pequeñas y factores de crecimiento para imitar ambientes de nicho de tejido y facilitar el «cultivo organoide» .
En 1975, Rheinwald y Green establecieron el primer ejemplo exitoso de cultivo de células madre adultas humanas utilizando queratinocitos humanos . Específicamente, mantuvieron queratinocitos humanos a largo plazo en combinación con una línea celular de fibroblastos de ratón irradiada subletalmente, 3T3-J2. Aunque no usaron el término «células madre» para los queratinocitos clonados cultivados en células 3T3, Green y sus colegas encontraron colonias con la notable capacidad de dividirse y formar nuevas colonias después del paso, que denominaron «Holoclonas» . Estas holoclonas consisten en células pequeñas e inmaduras que todas exhibieron una intensa tinción nuclear con p63, un regulador maestro del tallo, en células epiteliales estratificadas . En el epitelio estratificado, que incluía piel, bronquios pulmonares, glándula mamaria y urotelio vesical, la población de células madre se localizó principalmente en la capa basal y las células inmaduras se teñieron con p63, de acuerdo con los estudios in vitro . Significativamente, los queratinocitos humanos aislados y expandidos de piel autóloga se han injertado con éxito para quemar pacientes y regenerar una epidermis permanente que se asemeja al resultado de injertos de piel de grosor dividido . En particular, se ha aplicado el mismo procedimiento para aislar y expandir las células epiteliales corneales humanas para trasplante . Aunque esta tecnología se limitaba a las células madre en la epidermis y la córnea en ese momento, Green y sus colegas crearon la base para la clonación de células madre adultas humanas en los campos de la biología básica y la medicina regenerativa.
En este artículo de revisión, ofrecemos una visión general del progreso de la investigación reciente y la acumulación de pruebas de un sistema de cultivo celular que ha dado lugar a avances técnicos en tecnologías de células epiteliales. Nuevas estrategias de cultivo para células epiteliales estratificadas y células epiteliales columnares han permitido recapitular el desarrollo epitelial humano y pueden utilizarse para generar un modelo de enfermedad humana in vitro. También discutimos las aplicaciones potenciales y posibles de las tecnologías de cultivo de células epiteliales normales para la medicina regenerativa y destacamos un sistema de cultivo de células cancerosas que reproduce fenotipos individuales de pacientes.
Cultivo de células epiteliales estratificadas
En tejidos epiteliales estratificados, incluidos el epitelio glandular y pseudoestratificado, las células p63+, que se localizan en la membrana basal, pueden renovarse automáticamente para mantener las poblaciones madre / progenitora y dar lugar a progenie que forman tejidos funcionales . Como se mencionó anteriormente, la clonación y expansión de células madre epiteliales, como los queratinocitos de la piel y las células epiteliales de la córnea, han estado bien establecidas en sistemas de cocultivo con fibroblastos 3T3-J2 de ratón irradiados. Sin embargo, este protocolo estándar se ha limitado en gran medida al cultivo a largo plazo de queratinocitos y células corneales. Sin embargo, se han notificado células madre clonadas de epitelios tímicos, al igual que el aislamiento de células madre epiteliales tímicas de diversas especies, incluidas células humanas, cultivadas con un sistema de alimentación 3T3 . Además, Frey y sus colegas aplicaron recientemente el método de alimentación 3T3 para aislar células madre uroteliales que expresaban erizo sónico y residían en la capa basal del urotelio de la vejiga . Estas células madre uroteliales de tejido humano y porcino aislado se cultivaron de forma estable en una capa alimentadora 3T3 y fueron capaces de dar lugar a múltiples linajes celulares, incluidas las células basales p63+ y las células uroteliales de Uroplaquina 2+ y 3+, después del trasplante de cápsulas renales en ratones desnudos. En 2011, Pooja et al. explotó el sistema de cultivo 3T3 para aislar tres tipos de células madre epiteliales de las vías respiratorias humanas, i. e., células madre nasales, traqueales y distales de las vías respiratorias, y encontró que estas células madre epiteliales de las vías respiratorias exhibían fenotipos celulares distintos después de la diferenciación in vitro, aunque los clones de células madre inmaduras parecían ser morfológicamente indistinguibles (Fig. 1) . En un estudio de seguimiento, el trasplante de células madre epiteliales traqueales y distales de las vías respiratorias de ratón demostró que las células madre de las vías respiratorias distales se incorporaban fácilmente al tejido pulmonar dañado por la gripe H1N1 y se diferenciaban en múltiples tipos de células epiteliales, p. ej., bronquiolos y alvéolos, mientras que las células madre traqueales trasplantadas se localizaron solo en las vías aéreas principales . También se aislaron células madre clonogénicas de muestras de biopsia endoscópica de esófago humano, y estas células pudieron formar estructuras escamosas, estratificadas y bien diferenciadas similares a epitelios en un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI).
Esquema del proceso de cultivo celular para células madre epiteliales estratificadas y columnares humanas en una capa alimentadora de ratón 3T3. Para las células madre epiteliales estratificadas, se aíslan de biopsias o se platean muestras quirúrgicas en una capa 3T3 para un cultivo a largo plazo. Para las células madre epiteliales columnares, se platean en una capa 3T3 con factores definidos que son esenciales para el crecimiento y mantenimiento de las células madre. Colonias morfológicamente inmaduras (colonias empaquetadas con células pequeñas) de células madre epiteliales se recogen mecánicamente para una expansión más homogénea. En el cultivo ALI, las células se diferencian en tipos de células maduras en un Transwell
Schlegel y sus colegas informaron que un inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) en combinación con células alimentadoras 3T3 aumentó significativamente la capacidad proliferativa de las células madre epiteliales, incluidos los queratinocitos humanos, las células de la próstata y las células de la glándula mamaria, y denominaron a este fenómeno «reprogramación condicional» . La capacidad de generar de manera eficiente cultivos de células madre epiteliales a partir de pacientes proporciona información crítica y valiosa sobre el diagnóstico y la terapéutica basados en células . Más recientemente, Rajagopal y sus colegas mostraron que la vía de señalización TGFß/BMP/SMAD es importante en varios tejidos epiteliales, incluidos el tejido de la piel y la glándula mamaria derivado de ectodermos, el tejido del esófago y la próstata derivado de endodermos y el epidídimo derivado de mesodermos. Descubrieron que la inhibición dual de la señalización SMAD (la señal BMP fue bloqueada por DMH-1 y la señal TGFß fue inhibida por A-83-01) facilitó la propagación estable de poblaciones de células basales epiteliales humanas y de ratón. Sorprendentemente, la inhibición dual de TGFß / BMP permitió la expansión robusta de las células madre epiteliales sin la necesidad de células alimentadoras 3T3 de ratón.
En conjunto, estos avances técnicos, en combinación con pequeñas moléculas y células alimentadoras, se pueden utilizar para expandir continua y eficientemente las poblaciones madre/progenitora epiteliales estratificadas in vitro. Otro avance en el cultivo epitelial estratificado, el cultivo organoide, se ha utilizado para expandir los progenitores prostáticos humanos basales y luminales. Estos progenitores luminales humanos eran multipotentes y formaron estructuras similares a la glándula prostática in vitro . Sin embargo, la generación de estructuras tridimensionales que consisten en epitelios estratificados o pseudoestratificados para recapitular la arquitectura auténtica in vivo sigue siendo un desafío, aunque muchos investigadores han reportado cultivos esferoides y organoides. Este problema puede resolverse estableciendo un método para facilitar la autoorganización, como se realiza en tejidos derivados de células madre pluripotentes .
Cultivo de células epiteliales columnares
Aunque las células madre intestinales poseen la notable capacidad de proliferar a una alta tasa de rotación para mantener el epitelio intestinal, y los hepatocitos son altamente regenerativos en respuesta al daño, la capacidad de clonar poblaciones de células madre a partir de células epiteliales columnares está severamente limitada, presumiblemente debido a la falta de señales de nicho de tejido in vitro. Durante la última década, Clevers y sus colegas descubrieron LGR5 (receptor acoplado a proteína G con contenido repetido rico en leucina 5), un marcador de células madre intestinales, en un modelo sofisticado de ratón (ratones Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 cruzados con el reportero Rosa26 LacZ activado por Cre) y establecieron un método de cultivo organoide intestinal de ratón que consiste en estructuras similares a vellosidades y zonas similares a criptas con múltiples tipos de células intestinales . En combinación con factores de crecimiento y cócteles de moléculas pequeñas, una fracción aislada de células madre LGR5+ se suspendió en Matrigel y se cultivó a largo plazo . Modificando la condición de cultivo con el uso de nicotinamida, un inhibidor de los receptores p38 y TGFß, las células epiteliales humanas aisladas del intestino delgado y el colon pudieron expandirse infinitamente a largo plazo in vitro . Esta técnica es aplicable al cultivo de otros tipos de células, como las células del conducto pancreático y los hepatocitos , y facilitó los avances revolucionarios en el cultivo de células epiteliales columnares.
El cultivo organoide emplea una plataforma de cultivo 3D basada en Matrigel y se puede utilizar ampliamente para cultivar de forma estable diversos tipos de células epiteliales adultas, incluidas las células epiteliales estratificadas, con poblaciones de células madre/progenitoras . Sin embargo, la capacidad de propagar rápida y eficientemente una fracción de células madre uniformes in vitro también es útil e importante para el estudio detallado de la autorrenovación y la especificación del destino en células madre de tejidos y posibles aplicaciones futuras de trasplante de células para medicina regenerativa. Xian y sus colegas desarrollaron recientemente un novedoso sistema de cultivo para la expansión homogénea de las células madre intestinales fetales humanas, incluidas las células del intestino delgado y del colon. Este sistema empleó una capa alimentadora de ratón 3T3 en combinación con factores de crecimiento e inhibidores de la vía de señal para expandir robustamente las células madre epiteliales cilíndricas humanas (Fig. 1) . Además, más del 50% de las células madre intestinales cultivadas en fibroblastos 3T3 pudieron formar colonias. En el intestino de los mamíferos, los factores de nicho definidos, como las señales Wnt y Notch, son esenciales para gobernar la vástago de las células madre intestinales en la base de la cripta. Además, las células de Paneth, que también se encuentran en la base de la cripta, surgen de células madre y actúan como nicho de células madre al proporcionar factores esenciales de manera paracrina. Debido a que los cultivos organoides consisten en células madre y varios derivados, como las células de Paneth, los factores de nicho se suministran de forma autónoma . Por el contrario, debido a que una población pura de células madre intestinales se cultiva en una capa alimentadora 3T3, las células no pueden secretar factores de nicho. Por lo tanto, es necesario complementar los factores extrínsecos que se asemejan a factores de nicho. Además del protocolo de mantenimiento de células madre, se ha establecido un protocolo de diferenciación en un modelo de cultivo ALI para dar lugar a al menos cuatro tipos de células intestinales principales, es decir, células de Paneth, células enterocrino, células cálices y enterocitos (células absorbentes intestinales) . Se observó la formación de estructuras similares a vellosidades intestinales de acuerdo con los tipos de tejidos originales, como el intestino delgado y los tejidos del colon (Fig. 1). En un enfoque de cultivo ALI diferente, Kuo y sus colegas cultivaron robustos trozos pequeños de intestino neonatal de ratón con un elemento estromal a largo plazo .
La misma estrategia se aplicó también a las células madre gástricas humanas clonadas obtenidas a partir de biopsia endoscópica. Específicamente, las células gástricas clonogénicas se expandieron de forma estable en una capa alimentadora 3T3 en combinación con factores de crecimiento y moléculas pequeñas y se diferenciaron en linajes epiteliales gástricos que se encuentran típicamente en el estómago, como las células principales que expresan pepsinógeno . Además de las células madre de órganos digestivos clonadas, las células progenitoras de oviducto del tubo uterino distal también pudieron propagarse infinitamente en una capa alimentadora 3T3 en presencia de factores de nicho . El oviducto distal, epitelio de fimbria, es una capa de epitelio cilíndrico simple que consta de los siguientes dos tipos de células: células ciliadas, que mejoran el transporte de gametos, y células secretoras, que secretan moco. Usando una ligera modificación del protocolo de diferenciación para las células madre intestinales, las células madre oviductales cultivadas a largo plazo dieron lugar a una arquitectura 3D, que contenía células ciliadas y secretoras, que recordaba la estructura del epitelio in vivo . La capacidad de producir linajes epiteliales con tipos de células adecuados a partir de una población de células madre podría ser una herramienta útil para estudiar el desarrollo epitelial fisiológico y la homeostasis y desarrollar modelos de enfermedades agudas y crónicas in vitro.
Cultivo celular de cáncer
Desde que se estableció la primera línea celular de cáncer, la línea celular HeLa, a partir de un paciente con cáncer de cuello uterino en 1951 , las líneas celulares de cáncer establecidas a partir de una amplia variedad de tipos de cáncer se han utilizado ampliamente para estudiar la patobiología del cáncer y brindaron oportunidades para generar modelos de xenoinjertos in vivo y probar medicamentos anticancerosos in vitro e in vivo. Aunque se han logrado enormes avances en la biología del cáncer mediante el uso de líneas celulares cancerosas, es posible que los resultados obtenidos con estas células no reflejen suficientemente la complejidad de la enfermedad como se esperaba originalmente porque el cáncer presenta heterogeneidad entre pacientes e intratumores, como revelan los avances recientes en la secuenciación de próxima generación . Para reflejar con mayor precisión los fenotipos de cáncer, incluido el estado de mutación genética y la patología del paciente, Welm y sus colegas desarrollaron modelos de xenoinjerto (PDX) derivados del paciente de cáncer de mama en ratones diabéticos no obeses con inmunodeficiencia combinada grave (NOD-SCID) que mantuvieron las características esenciales de los tumores originales y exhibieron capacidad metastásica en sitios específicos . Además del modelo de cáncer de mama, el establecimiento de varios tipos de tumores sólidos demostró la viabilidad de los modelos PDX , que se espera aceleren las pruebas preclínicas de nuevas terapias contra el cáncer y ayuden a alcanzar el objetivo de la «medicina personalizada».
Los métodos de cultivo para células madre adultas, como los sistemas organoides y de alimentación, también se pueden aplicar a diferentes enfoques que utilizan células cancerosas derivadas del paciente. Específicamente, Clevers y sus colegas informaron que el cultivo organoide se puede usar para modelar el cáncer de páncreas , próstata y colorrectal y mostraron que los rasgos originales del cáncer , incluida la heterogeneidad genética y la sensibilidad a los medicamentos, se pueden recapitular. Por lo tanto, denominaron a este sistema un «biobanco organoide vivo». Estas tecnologías también podrían usarse para aislar una población de células madre de una lesión precancerosa, como el esófago de Barrett, un precursor del adenocarcinoma esofágico humano . Las células madre aisladas y expandidas del esófago de Barrett se transformaron mediante la introducción de antígeno T grande SV40, hTERT y c-myc y se xenoinjertaron en ratones inmunocomprometidos NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ). Como era de esperar, las células madre del esófago de Barrett se transformaron en tumores tipo adenocarcinoma esofágico en ratones. Un enfoque similar demostró que las células madre oviductales humanas eran la célula de origen en el cáncer epitelial de ovario seroso de grado alto . Este hallazgo corrobora la patología humana reciente y la evidencia del modelo de ratón transgénico, que indicó que el epitelio oviductal distal es el tejido de origen de este cáncer . En combinación con el sistema CRISPR/Cas9, las células madre de colon normales se transformaron secuencialmente introduciendo las mutaciones conductoras que se detectan con frecuencia en el cáncer colorrectal . Se permitió que las células resultantes formaran xenoinjertos en la cápsula renal y mostraron una transformación progresiva en fenotipos tipo adenocarcinoma caracterizados por propiedades invasivas y metastásicas. En general, la capacidad de aislar y cultivar células de tejidos epiteliales normales compatibles con tumores y pacientes facilita la producción de una plataforma que no solo complementa el trabajo clásico con animales in vivo en el campo de la biología del cáncer, sino que también facilita los enfoques de genética y genómica específicos del paciente in vitro.
Modelar la enfermedad inflamatoria con células madre adultas
Modelar la enfermedad humana se ve obstaculizada por la accesibilidad limitada de los tejidos enfermos humanos. Sin embargo, los avances en el cultivo de células madre adultas nos han permitido reproducir fenotipos de enfermedades in vitro mediante la expansión de células madre y la obtención de tipos de células maduras a partir de pequeñas muestras de biopsia humana. Debido a que los métodos de cultivo 3D, como el ALI y el cultivo organoide, proporcionan estructuras que consisten en múltiples tipos de células y se asemejan a la arquitectura del epitelio observada in vivo, deben ser adecuados para estudiar enfermedades inflamatorias, incluidas las enfermedades infecciosas y hereditarias. Específicamente, reproducir el fenotipo de la enfermedad es simple cuando se conocen el patógeno (o la causa principal) y el tipo de célula objetivo.
La colitis pseudomembranosa (PMC) es causada por un aumento desproporcionado de la población de Clostridium difficile (C. difficile) después del tratamiento con antibióticos. C. difficile es una bacteria Gram positiva, formadora de esporas, y produce las toxinas de alto peso molecular TcdA y TcdB, que inducen secreción de líquidos, inflamación y daño al tejido del colon. Las células epiteliales colónicas diferenciadas de las células madre colónicas clonogénicas en el cultivo de ALI fueron desafiadas con estas toxinas, lo que causó un daño epitelial devastador de una manera dependiente del tiempo y de la dosis. Este resultado indicó que el modelo de cultivo 3D puede ser utilizado para representar la patología de C. difficile . De manera similar, el efecto de la infección por Helicobacter pylori (H. pylori), que causa gastritis crónica, úlceras gástricas y cáncer, se estudió mediante microinyección de H. pylori en cultivos organoides. Los cultivos organoides infectados por bacterias mostraron un aumento de la inflamación, como la activación de NF-kB y la inducción de IL8, y la expresión de IL8 fue significativamente mayor en cultivos organoides de tipo glándula que en cultivos organoides de tipo fosa .
También se han utilizado células madre adultas para modelar enfermedades hereditarias. Beekman y sus colegas informaron de un cultivo organoide intestinal derivado de pacientes con fibrosis quística (FQ). La FQ es causada por mutaciones en el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que normalmente se expresa en las células epiteliales de muchos órganos, como los tejidos pulmonares y digestivos. Aunque los cultivos organoides intestinales normales mostraron una hinchazón robusta en respuesta a la forskolina, la respuesta a la hinchazón no se observó en los cultivos organoides de FQ . Además, cuando se corrigió el locus CFTR mutado utilizando la tecnología CRISPR / Cas9 en organoides intestinales de pacientes con FQ, se demostró que los genes corregidos funcionalmente funcionan . Por lo tanto, la diferenciación in vitro de células madre adultas, que se asemeja a fenotipos in vivo con múltiples tipos de células en combinación con tecnologías de edición de genes, proporciona medios poderosos para tratar enfermedades humanas y puede proporcionar una visión directa de la patología humana.
Aplicación de células madre epiteliales para medicina regenerativa
A pesar de las estrategias prometedoras que utilizan células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas (iPS) para aplicaciones en medicina regenerativa, hay pocos ensayos clínicos de estas estrategias en curso, lo que se debe en parte a las dificultades en la especificación del linaje y la posibilidad de tumorogénesis. Debido a que las células madre adultas se dedican esencialmente a tipos de tejido específicos, producir tipos de células intencionales es relativamente fácil y el riesgo potencial de carcinogénesis es bajo. Por lo tanto, los enfoques terapéuticos apuntan a utilizar células madre adultas como fuente celular para el trasplante. Aunque Green y sus colegas establecieron el método de cultivo de queratinocitos humanos en 1975 y las células cultivadas se trasplantaban a pacientes con quemaduras o lesiones químicas, el cultivo a largo plazo de otros tipos de células madre adultas estaba sujeto a barreras técnicas significativas. Como se describió anteriormente, los avances técnicos recientes superaron esta limitación para diversos tipos de células epiteliales. Por lo tanto, la capacidad de expandir rápida y eficientemente las poblaciones de células madre es valiosa para su uso en medicina regenerativa.
Por ejemplo, las células madre colónicas Lgr5+ de ratón se han expandido en cultivo organoide y trasplantado en el colon de ratón dañado, y se detectaron células injertadas que pudieron autorrenovarse y diferenciarse incluso después de 25 semanas . En un enfoque diferente, Zhang K y sus colegas aprovecharon células madre adultas diseñadas para un estudio de trasplante. Primero, cultivaron con éxito células epiteliales de la córnea en un plato sin células alimentadoras y luego descubrieron que Pax6 es un factor de transcripción clave que diferencia las células madre de la córnea (CSC) de los queratinocitos de la piel. Sorprendentemente, la sobreexpresión de Pax6 en queratinocitos indujo células similares a células madre limbales, y estas células podrían trasplantarse a las córneas lesionadas de los conejos . Debido a que los queratinocitos son más fácilmente accesibles que las CSC, este método puede ser aplicable para el tratamiento de la enfermedad ocular humana. Más recientemente, Liu et al. se informó de un enfoque atractivo para la reparación y regeneración de tejidos que utilizaba células madre endógenas. En su estudio, las células madre epiteliales del cristalino (LEC) que expresaban Pax6 y Bmi1 se caracterizaron y exhibieron potencial regenerativo in vivo. Se empleó un método quirúrgico de eliminación de cataratas que preserva los LEC endógenos, y estos LEC contribuyeron a la regeneración espontánea de lentes con función visual en conejos, macacos y bebés humanos. Este método podría ser un avance terapéutico para el tratamiento de cataratas y potencialmente reemplazar la implantación de lentes intraoculares artificiales .
Debido a las altas tasas de renovación de muchas células epiteliales, el trasplante de poblaciones de células madre es esencial para el mantenimiento de tejidos a largo plazo. Teóricamente, una sola célula madre puede reconstituir tejidos enteros, y varios grupos de investigación demostraron empíricamente esta noción . A pesar del potencial de las células madre pluripotentes (PSC), que pueden dar lugar a todo tipo de células, es probable que las células madre tisulares derivadas de PSC no puedan mantenerse en estado inmaduro in vitro. Por lo tanto, el uso de células madre adultas para la medicina regenerativa presenta una ventaja significativa.