Braz J Med Biol Res, mayo de 2004, Volumen 37(5) 625-634
El uso de la transcripción inversa-PCR para el diagnóstico de enfermedad granulomatosa crónica ligada al cromosoma X
P. Agudelo-Flórez1, J. A. López 1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 y A. Condino-Neto1
1Centro de Investigación en Pediatría y Departamentos de Pediatría y Farmacología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil
2departamento de Inmunología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brasil
3Disciplina de Alergia, Inmunología y Reumatología, Departamento de Pediatría, Escuela Paulista de Medicina, Universidad Federal de Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brasil
4laboratorio de investigación médica 56, departamento de dermatología, Facultad de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Resumen
Introducción Pacientes y métodos Resultados
Discusión Agradecimientos
Correspondencia y notas de pie de página
Resumen 
La enfermedad granulomatosa crónica (ECG) es un trastorno hereditario del sistema inmunitario innato caracterizado por una explosión oxidativa defectuosa de fagocitos y el consiguiente deterioro de su actividad microbicida. Las mutaciones en uno de los componentes de la NADPH-oxidasa afectan la expresión génica o la función de este sistema, lo que conduce al fenotipo de CGD. Los defectos en gp91-phox conducen a una ECG ligada al cromosoma X, responsable de aproximadamente el 70% de los casos de ECG. La investigación del genotipo altamente heterogéneo de los pacientes con ECG incluye análisis de mutaciones, ensayos de blot Norte o Western según el caso particular. El objetivo del presente estudio fue utilizar la transcripción inversa (RT)-PCR para el análisis de defectos moleculares responsables de la ECG ligada al cromosoma X en ocho pacientes brasileños y evaluar su potencial para una aplicación más amplia al cribado molecular en ECG. El ARN total se preparó a partir de linfocitos B transformados por el virus de Epstein B y se transcribió inversamente utilizando hexámeros aleatorios. El ADN resultante fue amplificado por PCR mediante pares de cebadores específicos y superpuestos diseñados para amplificar tres regiones del gen gp91-phox: exones 1-5, 3-9 y 7-13. Esta estrategia detectó expresión defectuosa de gp91-phox en siete pacientes. Los resultados de la PCR-RT coincidieron con la historia clínica, los datos bioquímicos (ensayo de liberación de tetrazolio o superóxido de nitroblue) y el análisis de mutación disponible en cuatro casos. En tres casos adicionales, los resultados de la RCP-RT coincidieron con la historia clínica y los datos bioquímicos. En otro caso, la PCR-RT fue normal a pesar de una historia clínica compatible con ECG y ráfaga respiratoria defectuosa. Concluimos que esta nueva aplicación del análisis RT-PCR, un método simple, económico y rápido, fue apropiada para el cribado de defectos moleculares en 7 de 8 pacientes con ECG ligada al cromosoma X.
Palabras clave: Superóxido, Fagocitos, Inmunodeficiencia primaria, ráfaga respiratoria, Neutrófilos, Humanos
Introducción
La enfermedad granulomatosa crónica (ECG) es una inmunodeficiencia primaria descrita originalmente en 1957 como una entidad clínica que afecta a los bebés varones y nombrada, en ese momento, enfermedad granulomatosa mortal de la infancia. Las principales características de la ECG son las infecciones recurrentes y graves que involucran las barreras naturales del organismo, como las vías respiratorias y los ganglios linfáticos, y eventualmente las estructuras internas, como el hígado, el bazo, los huesos y el cerebro (1-3). La incidencia estimada de esta enfermedad rara es de 1/250. 000 nacidos vivos al año. Las infecciones generalmente son causadas por bacterias catalasas negativas como Staphylococcus aureus, bacilos Gram negativos y especies de hongos como Aspergillus, Candida y Nocardia (4,5).
El sistema NADPH-oxidasa genera superóxido y otros intermedios reactivos de oxígeno, cruciales para la actividad microbicida de los fagocitos. El defecto bioquímico en la ECG es un deterioro de la actividad de la NADPH-oxidasa y la consiguiente incapacidad para destruir microorganismos (6). Los componentes principales del sistema de NADPH-oxidasa son gp91, p22, p47, p67 y p40-phox. Los defectos moleculares que causan CGD se deben generalmente a la ausencia, baja expresión o mal funcionamiento de uno de los componentes de la NADPH-oxidasa. La forma ligada al cromosoma X de esta enfermedad es causada por defectos en gp91-phox, la cadena pesada del citocromo b588, y representa aproximadamente el 70% de todos los casos (7,8). Las formas autosómicas recesivas son causadas por defectos en uno de los componentes citosólicos de la NADPH oxidasa (p47 – o p67-phox, respectivamente en 20 y 5% de los casos), o en el componente de cadena ligera del citocromo b588 (p22-phox, 5% de los casos) (9,10). La ECG es una enfermedad muy heterogénea: se han registrado más de 300 mutaciones en una base de datos de ECG-X mantenida internacionalmente (8). Las mutaciones se han distribuido en gran medida dentro de los 13 exones o en los límites exón/intrón del gen gp91-phox (CYBB) y casi 200 de estas mutaciones son únicas.
El diagnóstico de ECG se basa generalmente en las características clínicas de la enfermedad más la actividad defectuosa de la NADF-oxidasa, como se demuestra en ensayos anormales de tetrazolio de nitroblue (NBT), dihidrorodamina 123 o liberación de superóxido (11,12). En la prueba de TNB estimulada, los individuos normales muestran casi el 100% de células positivas, mientras que en los pacientes con ECG menos del 5% de las células son positivas (13). Además, las células de pacientes con ECG variante son positivas, pero solo muestran una actividad muy baja (6). La prueba NBT también detecta a los portadores de la ECG ligada al cromosoma X (madres y hermanas). Se establece un diagnóstico molecular definitivo de DGC en pacientes con una prueba de TNB anormal o actividad de estallido respiratorio que tienen una de las siguientes características: una mutación en gp91, p22, p47 o p67-phox; ausencia de ARNm para uno de estos genes detectado por el análisis de frotis Septentrional; y/o ausencia de proteína para uno de estos componentes de oxidasa por frotis occidental. Se puede establecer un diagnóstico genético, pero no molecular, mediante la demostración de primos, tíos o sobrinos maternos con una prueba de TNB anormal o una explosión respiratoria (14). Por lo tanto, el establecimiento de un diagnóstico definitivo de esta enfermedad rara y altamente heterogénea requiere metodologías complejas y costosas, como una combinación de blot Norte u Western, y análisis de polimorfismo de conformación de una sola hebra (SSCP) seguido de secuenciación de ADN de varios miembros de la familia, todo realizado en laboratorios de investigación de alta complejidad.
El método de transcripción inversa-PCR (RT-PCR) implica la amplificación de ADNc por PCR. Esta técnica se puede estandarizar fácilmente en laboratorios menos sofisticados. Proporciona información sobre la expresión génica y datos preliminares sobre la estructura o el tamaño del ARNm del componente defectuoso. La RT-PCR rara vez se ha utilizado en la investigación de ECG, limitándose a estudios fisiopatológicos (15-29). Hasta la fecha, el uso potencial de esta útil herramienta para establecer el diagnóstico definitivo de la ECG ligada al cromosoma X, la forma más frecuente, no ha sido ampliamente investigado. El objetivo de este estudio fue evaluar el uso de RT-PCR para el cribado de defectos moleculares responsables de la ECG ligada al cromosoma X, una inmunodeficiencia rara y posiblemente mal diagnosticada, en ocho pacientes brasileños.
Pacientes y métodos
Pacientes
El estudio incluyó a 8 pacientes brasileños varones no emparentados con probable ECG ligada al cromosoma X (2 negros y 6 caucásicos; edad 2-8 años; estatura 88-108 cm; peso 11-19 kg). Los pacientes presentaron historias clínicas de infecciones graves recurrentes como neumonía, linfadenitis, abscesos hepáticos, piodermitis y reacciones adversas a la inmunización con BCG. Fueron remitidos a nuestro laboratorio para su evaluación diagnóstica bioquímica y molecular. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes antes del estudio. El Comité de Ética de la Facultad de Medicina aprobó el protocolo de conformidad con el Convenio de Helsinki y la Resolución 196/96 del Ministerio de Salud de Brasil.
Diagnóstico bioquímico de ECG
El diagnóstico bioquímico de ECG se estableció de acuerdo con los criterios del Grupo Panamericano de Inmunodeficiencias. Se demostró un deterioro de la actividad de la NADF-oxidasa mediante la prueba de deslizamiento de NBT y/o el ensayo de liberación de aniones superóxido por neutrófilos de sangre periférica y leucocitos mononucleares (14,30,31). Se obtuvieron neutrófilos y leucocitos mononucleares mediante centrifugación de muestras de sangre sobre un gradiente de densidad Ficoll-Hipaco (32).
La prueba de portaobjetos de NBT se basó en la reducción de NBT a formazan por leucocitos activados (31). El ensayo se realizó como se describió anteriormente (30). Más del 95% de los 200 neutrófilos normales estimulados con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) de 30 nM deberían ser capaces de reducir el NBT. Se consideró que la ausencia de reacción o <5% de células positivas indicaban un diagnóstico de ECG (14).
Se evaluó la liberación cuantitativa de superóxido por neutrófilos y leucocitos mononucleares mediante un ensayo de reducción del citocromo c inhibible de superóxido dismutasa modificado (33-35). La cantidad de superóxido liberado se calculó utilizando un coeficiente de extinción de 0,21 nM/cm para el citocromo c. Los resultados se reportan como superóxido de nmol liberado por 106 células por hora. Los pacientes con ECG mostraron menos del 10% de los valores de control.
Detección de defectos moleculares responsables de la ECG ligada al cromosoma X
Los linfocitos B de pacientes con ECG ligada al cromosoma X se transformaron in vitro con el virus de Epstein B (VEB) (15,16) para proporcionar una fuente abundante de ácidos nucleicos para estudios moleculares. Las líneas de células B transformadas por VEB reproducen los defectos bioquímicos y moleculares de los pacientes con ECG (15,16,36) y eliminan la necesidad de recolecciones de sangre repetidas. En resumen, se cultivaron leucocitos de sangre periférica de pacientes con ECG ligada al cromosoma X con sobrenadantes de B95-8, una línea celular productora de VEB (15,16,36,37), en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor (10%), 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, a 37ºC, en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. Se monitorizó la viabilidad celular y se mantuvieron los cultivos durante todo el período de estudio.
Se prepararon muestras de ARN de líneas de células B transformadas por VEB por el método HCl de guanidina, seguido de precipitación y cuantificación de etanol por métodos estándar (38,39). Las muestras de ADNc se obtuvieron mediante transcripción inversa de 2 µg de ARN total con SuperÍndice II RT (GIBCO BRL) y hexámeros aleatorios (15). La calidad de las muestras de ARNm se comprobó mediante amplificación por PCR de ß-actina, un control genético constitutivo (bp 920-943 y bp 1494-1471) (Gen Bank accession No. NM001101).
la expresión génica gp91-phox se evaluó mediante RT-PCR. Pares de cebadores específicos y superpuestos (Gen Bank accession No. NM_000397, Tabla 1) se utilizaron para amplificar (30 ciclos) tres regiones exónicas gp91-phox: 1-5, 3-9 y 7-13. Esta estrategia nos permitió detectar todos los exones gp91-phox. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y se teñieron con bromuro de etidio.
La expresión génica relativa gp91-phox se analizó con el software Image Master (Pharmacia-Biotech). El resultado de la densitometría para las muestras diana se dividió por el resultado de la densitometría de ß-actina, un control genético constitutivo, normalizando el nivel considerado para el análisis. Los resultados de los ensayos RT-PCR se compararon con la historia clínica del paciente, los ensayos bioquímicos (ensayo de liberación de NBT y/o superóxido) y los datos de análisis de mutaciones disponibles (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ índice.ats).
Resultados
Estudiamos a 8 pacientes varones con historias clínicas de infecciones graves recurrentes, remitidos a nuestro laboratorio para el diagnóstico bioquímico y molecular de la ECG. Los resultados de las pruebas de portaobjetos NBT y de los ensayos de liberación de superóxido se muestran en la Tabla 2. Seis de los pacientes presentaron menos de 5% de leucocitos positivos en la prueba de portaobjetos NBT. Seis pacientes mostraron un deterioro de la liberación de superóxido por parte de los granulocitos y / o leucocitos mononucleares (menos del 10% en comparación con los controles sanos). Cuatro pacientes tuvieron resultados anormales en ambas pruebas. Todos los pacientes presentaron al menos una prueba anormal y recibieron el diagnóstico de probable ECG ligada al cromosoma X. La madre y la hermana de la paciente T. B. P. presentaron una prueba de portaobjetos NBT compatible con el estado portador de la ECG ligada al cromosoma X. Durante el período de estudio, un paciente (G. M.) murió de neumonía.
A continuación investigamos el diagnóstico definitivo de ECG ligada al cromosoma X mediante análisis RT-PCR de la expresión génica gp91-phox. Los resultados de la amplificación RT-PCR con tres juegos de cebadores superpuestos se presentan en la Tabla 2. La calidad de la muestra de ARNm se comprobó mediante amplificación por PCR de ß-actina, un control genético constitutivo. En este caso se obtuvieron los productos normales esperados (Figuras 1, 2 y 3).
En cuatro casos, fue posible comparar los datos de RT-PCR con el análisis de mutaciones disponible, presentado en otra parte por Patiño et al. (30) o por nuestro grupo ( //www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. presentó una transición C469 ® T en el exón 5, prediciendo una mutación sin sentido (R157X). M. F. presentó una sustitución sin sentido en el exón 3, R (arginina) 73-Stop. R. S. mostró una sustitución de 264 G®A en la unión de empalme de 3′ del exón 3 gp91-phox. La secuencia de ADNc mostró una deleción del exón 3 gp91-phox, dando lugar a un mutante inestable o no funcional gp91-phox. G. G. presentó un empalme defectuoso del exón 3 gp91-phox (aún no se ha determinado la mutación subyacente). Los otros pacientes siguen siendo investigados.
En conjunto, esta estrategia permitió detectar la expresión defectuosa de gp91-phox en siete de ocho pacientes. Los resultados de RT-PCR coincidieron con la historia clínica, los datos bioquímicos (ensayo de liberación de NBT o superóxido) y el análisis de mutaciones disponible en cuatro casos. En tres casos adicionales, los resultados de la RCP-RT coincidieron con la historia clínica y los datos bioquímicos. En otro caso, la PCR-RT fue normal a pesar de una historia clínica compatible con ECG, una ráfaga respiratoria defectuosa caracterizada por la prueba de NBT y el ensayo de liberación de superóxido y las pruebas de NBT de su madre y hermana compatibles con el estado portador de ECG ligada al cromosoma X.
Discusión
En este artículo se relatan los estudios bioquímicos y de expresión génica de 8 pacientes brasileños no emparentados con historia clínica de ECG, que fueron remitidos a nuestro laboratorio para una investigación detallada. La ECG es un trastorno hereditario poco frecuente en el que las células fagocíticas son incapaces de generar aniones superóxido y otros intermedios reactivos de oxígeno. Inicialmente, se estableció el diagnóstico de la probable ECG ligada al cromosoma X mediante métodos bioquímicos, como las pruebas de portaobjetos NBT y/o los ensayos de liberación de aniones superóxido. Nuestros resultados mostraron que todos los pacientes presentaban deterioro de la función de la NADPH-oxidasa y, a su vez, probable ECG ligada al cromosoma X.
Ambos métodos contribuyen al diagnóstico probable de la ECG de diferentes maneras. La prueba de láminas de NBT proporciona información sobre el número de células que reducen el NBT a formazan dentro del citoplasma y la intensidad de esta reducción. Por lo tanto, los pacientes con formas variantes de ECG ligada al cromosoma X muestran pruebas de láminas de NBT anormales, en las que la mayoría de las células reducen débilmente el NBT a formazan. La prueba de portaobjetos NBT también detecta portadoras femeninas de DGC ligada al cromosoma X. El ensayo de liberación de superóxido mide la reducción del citocromo c por el superóxido producido por los leucocitos activados presentes en la reacción, lo que permite el diagnóstico de formas variantes de ECG ligada al cromosoma X. Ambas pruebas se pueden estandarizar fácilmente en laboratorios de baja complejidad y ninguna de ellas requiere equipo costoso. La prueba de dihidrorodamina 123 es un método altamente sensible para el diagnóstico bioquímico de la ECG; sin embargo, requiere un citómetro de flujo, un instrumento muy costoso.
Evaluamos la expresión génica gp91-phox en linfocitos B transformados por VEB de pacientes con ECG mediante análisis RT-PCR. Se utilizaron pares de cebadores específicos y superpuestos para amplificar tres regiones del gen gp91-phox mediante RT-PCR: exones 1-5, 3-9 y 7-13. Esta estrategia permitió detectar la expresión defectuosa de gp91-phox en 7 de 8 pacientes. Los resultados de RT-PCR coincidieron con la historia clínica, los datos bioquímicos (ensayo de liberación de NBT o superóxido) y el análisis de mutaciones disponible en cuatro casos. En tres casos adicionales, los resultados de la RCP-RT coincidieron con la historia clínica y los datos bioquímicos.
La expresión génica gp91-phox se redujo en todas las regiones exónicas del paciente R. B. Esta reducción puede ser el resultado de mutaciones que conducen a una baja estabilidad del ARN o a una actividad transcripcional alterada. Pacientes G. M. y T. P. mostró ausencia de expresión de los exones 7-13, lo que sugiere que la disminución de la expresión de estos exones de extremo 3’adicionales puede ser el resultado de la inestabilidad del ARN o un defecto de empalme, por ejemplo, un empalme parcialmente correcto para producir una señal, pero un empalme parcialmente anormal para eliminar un sitio de unión de cebador, un sujeto a ser investigado por futuros análisis de mutaciones genómicas de ADN.
El paciente G. G. presentó un producto difuso, de baja abundancia, de menor tamaño de los exones 1-5 (Figura 1) y ausencia de expresión de otras regiones exónicas. Su análisis de mutación mostró un defecto en el sitio de empalme del exón 3. Del mismo modo, el análisis de mutación del paciente R. S. también reveló un defecto en el sitio de empalme del exón 3. Sin embargo, en este caso, se podría detectar un producto de PCR menos abundante.
El paciente M. F. presentó una expresión reducida de las regiones exónicas 3-9 y 7-13, lo que puede ser el resultado de una actividad transcripcional defectuosa en el exón 3. J. E. M. presentó una mutación sin sentido en el exón 5 que resultó en la pérdida de la expresión gp91-phox, como se evidencia en el análisis de RT-PCR, una posible consecuencia de la inestabilidad del ARNm mediada por tonterías.
En un caso, el paciente T. P. B., la expresión génica gp91-phox fue normal a pesar de tener antecedentes familiares compatibles con ECG y una actividad de ráfaga respiratoria defectuosa. En este caso, el diagnóstico de probable ECG ligada al cromosoma X se basó en pruebas de TNB anormales en su madre y su hermana, compatibles con el estado portador. Planteamos la hipótesis de que una mutación puntual, como una sustitución de base única que no cambia la longitud o abundancia de fragmentos de PCR, debería investigarse en este caso particular.
La RT-PCR es una herramienta poderosa para evaluar la expresión génica. Esta característica puede explicar en parte la variabilidad de la expresión génica gp91-phox entre los pacientes incluidos en este estudio, y la importancia de combinar pares de cebadores superpuestos para filtrar toda la longitud del mensaje. La RT-PCR se ha utilizado en estudios de casos aislados como parte del diagnóstico inicial de las diferentes formas de ECG (17-22). El análisis RT-PCR también fue útil en el diagnóstico prenatal de ECG, resultante de deficiencia de p47-phox (23). Sin embargo, se ha utilizado más comúnmente para el estudio de la regulación génica de los componentes de la NADPH-oxidasa en una variedad de células (15,16,24-29). Hasta la fecha, el uso potencial de esta útil herramienta para establecer el diagnóstico definitivo de la ECG ligada al cromosoma X, la forma más frecuente, no se ha investigado ampliamente. Se deben realizar estudios adicionales para comparar la sensibilidad y especificidad de esta prueba en comparación con otros ensayos complejos, como los blots occidentales o septentrionales.
En general, hemos demostrado que la RT-PCR, una metodología simple y de bajo costo, estableció el diagnóstico definitivo de la ECG ligada al cromosoma X en 7 de 8 casos, sin necesidad de utilizar metodologías complejas y costosas como Northern blot, slot blot, análisis SSCP o secuenciación genómica del ADN. Por lo tanto, la RT-PCR puede ser una herramienta adecuada para diagnosticar la ECG en laboratorios de países en desarrollo. Es muy importante determinar el defecto genético molecular definitivo para proporcionar el asesoramiento genético y el pronóstico adecuados a los parientes con ECG. Además, los estudios genéticos moleculares del sistema NADF-oxidasa humano avanzarán el conocimiento sobre este mecanismo de defensa crucial y antiguo.
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Agradecimientos
Los autores agradecen a los pacientes y a sus familiares por su participación y ayuda, y a la enfermera Silvana Severino por la asistencia técnica. Los autores también agradecen al Profesor Peter Newburger, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, la revisión crítica de este manuscrito.
Correspondencia y notas a pie de página