DISCUSIÓN
Este estudio proporciona evidencia de que las células β pueden funcionar bien en un sitio de injerto sin células no β cercanas. Para estudiar los injertos enriquecidos con células β, los islotes tuvieron que dispersarse en células individuales para permitir la clasificación celular activada por fluorescencia. Por lo tanto, nuestros estudios iniciales investigaron el efecto de la dispersión y la reagregación de islotes en el resultado del trasplante. Cuando las células dispersas se reagregaron antes del trasplante, se necesitaron menos células para revertir la hiperglucemia. Después de la IPGTTs, los islotes reagregados tenían un perfil de glucosa similar al de los ratones control no diabéticos y no trasplantados con compatibilidad de peso. Sin embargo, los ratones trasplantados con 2,5 millones de células de islotes dispersos tenían niveles de glucosa en sangre aún más bajos después de la prueba de tolerancia a la glucosa. Este hallazgo indica que el trasplante de células de islotes dispersos puede ser eficiente, siempre y cuando se trasplanten un número suficiente de células. Sin embargo, si las células de los islotes se vuelven a agrupar antes del trasplante, la mitad del número de células puede restaurar la normoglucemia. Estos resultados están en línea con varios estudios previos que han demostrado que las respuestas secretoras de insulina disminuyen en las células de los islotes dispersos y mejoran mediante la reagregación de las células (24-27). Este resultado superior puede deberse a una influencia positiva de la comunicación celular sobre la secreción de insulina y plantea preguntas sobre si las células agregadas son más resistentes a la apoptosis. Es probable que las células dispersas se agrupen in vivo después del trasplante, pero esto puede ocurrir después de que muchas células se pierdan en los primeros días después del trasplante. En resumen, es evidente que se requiere inicialmente un mayor número de células dispersas para revertir la hiperglucemia.
En nuestro siguiente estudio, las células de islotes dispersos se enriquecieron para células β mediante el uso de clasificación celular activada por fluorescentes. las células β se clasificaron de acuerdo con su fluorescencia endógena y dispersión directa (tamaño), como se ha descrito anteriormente (19-21). Usando esta técnica, pudimos obtener poblaciones celulares de β 95% de células β. Estas fracciones enriquecidas con células β se reagregaron antes del trasplante. Los ratones que habían sido trasplantados con agregados enriquecidos con células β tuvieron una rápida reversión de la hiperglucemia de manera similar a los ratones trasplantados con un volumen similar de islotes enteros. Cabe señalar que el número de células β habría sido menor en los trasplantes de islotes en comparación con los trasplantes de células β. Es probable que los trasplantes de células β, con un 95% de pureza de células β, contuvieran un 20% más de células β que en los islotes. Sin embargo, el objetivo del estudio era establecer si las células β purificadas, trasplantadas en volúmenes similares a los utilizados en el trasplante de islotes, podrían revertir la diabetes y establecer si las células β derivadas de células madre podrían ser útiles para el trasplante a pacientes diabéticos. En las pruebas de tolerancia a la glucosa 4 semanas después del trasplante, los ratones trasplantados con agregados enriquecidos con células β tenían niveles de glucosa en sangre ligeramente más bajos y tendían a tener niveles de insulina ligeramente más altos que los trasplantados con islotes. Sin embargo, a las 12 semanas no había diferencia entre estos grupos con respecto a la tolerancia a la glucosa, los niveles de insulina o el contenido de insulina del injerto. En esta serie experimental, los ratones de control no diabéticos y no trasplantados se compararon con la edad en lugar de con el peso. Mientras que el peso de los ratones trasplantados se había mantenido estable o disminuido durante su período de diabetes, los ratones de control continuaron aumentando de peso durante todo el estudio. Su pobre tolerancia a la glucosa y niveles más altos de insulina sugieren que estos ratones de control se habían vuelto resistentes a la insulina. Además, los niveles de glucosa más bajos de los ratones trasplantados pueden explicarse por el hecho de que se implantaron islotes de ratas, porque las ratas típicamente tienen niveles de glucosa más bajos que los ratones y pueden tener un punto de ajuste más bajo para la secreción de insulina estimulada por glucosa.
Estos resultados muestran que el resultado del trasplante de agregados enriquecidos con células β es similar al de los islotes. El trasplante de una población purificada de células β ha sido demostrado previamente por Keymeulen et al. (28) para tener éxito, aunque en este estudio se sugirió que la mezcla de células endocrinas no β con células β antes del trasplante mejoró la función del injerto. En el estudio Keymeulen, los injertos se estudiaron durante 64 semanas en lugar de las 12 semanas de este estudio. Sus injertos de células β de rata e injertos mixtos de células β de rata más células endocrinas no β de rata funcionaron bien en ratas hasta 2 20 semanas, cuando algunos de los injertos comenzaron a fallar. A las 64 semanas, todos los injertos, independientemente de si contenían células β purificadas o células β mezcladas con otras células endocrinas no β, habían fracasado parcial o totalmente. Sin embargo, implantaron alrededor de 1,2–1,7 millones de células β en ratas, lo que podría considerarse un modelo de masa mínima. Este estudio exhaustivo también mostró que las células β de donantes de ratas mayores no funcionan tan bien como las células β de donantes de ratas más jóvenes. Por lo tanto, el estudio Keymeulen complementa los hallazgos del presente estudio en el sentido de que ambos muestran una función impresionante de los injertos que consisten en células β purificadas. Otro tipo de célula dentro de los islotes que potencialmente podría contribuir al resultado del trasplante es la célula endotelial, que se ha reportado que contribuye a la revascularización de los islotes trasplantados (15,16). Sin embargo, no está claro que haya suficientes células para hacer una contribución significativa. Sin embargo, es evidente a partir de los estudios actuales que, aunque las células endocrinas no β y el endotelio del donante pueden ser beneficiosos para la función de los injertos de islotes trasplantados, no parecen ser esenciales para el trasplante exitoso. Este hallazgo indica que las células β derivadas in vitro de células madre o de alguna otra fuente podrían ser muy útiles para fines de trasplante.
Cuando se estudió la composición del injerto 12 semanas después del trasplante, los agregados enriquecidos con células β tenían prácticamente el mismo 5% de células no β en los injertos que en las preparaciones iniciales. Aunque esto no fue sorprendente, fue notable encontrar que los islotes que inicialmente tenían un 25% de células no β tenían solo un 5% dentro de los injertos. La gran mayoría de estas células son células α que contienen glucagón. Si los injertos enriquecidos con células β hubieran perdido células no β en el mismo grado que los injertos de islotes, se hubiera esperado que solo tuvieran un 1% de células no β después del trasplante. También es interesante que la pérdida de células no β en los injertos de islotes pareciera detenerse en un 5%, que era el mismo porcentaje de células no β que se encuentran en los injertos enriquecidos con células β. De acuerdo con estos hallazgos, también encontramos que cuando se trasplantaron racimos de células pancreáticas porcinas neonatales inmaduras a ratones desnudos, los injertos muchos meses después fueron β 95% de células β (29). Este fenómeno de los experimentos actuales con islotes de ratas podría explicarse por la muerte preferencial de las células no β como se describió anteriormente (30-33). Estos estudios y los nuestros concluyen que la disminución se explica principalmente por las células productoras de glucagón (30-33). No sabemos si las células δ y las células PP también desaparecen. La localización periférica de las células α en los islotes de roedores podría hacerlas potencialmente más vulnerables al daño durante el aislamiento. Aunque no hemos estudiado esto en detalle en el presente estudio, estudios anteriores han indicado que esta no es la razón principal de la pérdida de células α después del trasplante. En un estudio de Lau et al. (33), los islotes implantados en el hígado habían perdido células α a las 4 semanas después del trasplante, mientras que los islotes implantados en el riñón a partir del mismo aislamiento no lo habían hecho, lo que indica que los acontecimientos relacionados con el aislamiento no habían causado la pérdida de estas células periféricas (33). En ese estudio, los islotes implantados intraportalmente mostraron pérdida de células α, mientras que los islotes implantados debajo de la cápsula renal no mostraron pérdida de células α. En el presente estudio, observamos pérdida de células no β en islotes bajo la cápsula renal 1 semana después de la implantación. Una diferencia entre su estudio y este estudio es que implantaron islotes en ratas normoglucémicas, mientras que en el presente estudio, los receptores fueron ratones hiperglucémicos. Es posible que las diferencias en la carga metabólica en el injerto de islotes puedan afectar la supervivencia de las células α. No se puede descartar que la pérdida de células α sea más rápida en el sitio hepático, como Lau et al. (33) comunicado. Gunther et al. (31) notificaron la pérdida de células α tan solo 2 días después de la implantación en el hígado de ratas diabéticas (31). Debido a que los niveles normales de glucagón y otros péptidos derivados de células no β todavía son producidos por el páncreas endógeno, es posible que las células no β en los injertos desaparezcan debido a la involución para prevenir la hiperglucagonemia.
La pregunta hipotética, que un día puede ser de importancia práctica, es si un injerto de células β puras proporcionaría un resultado de trasplante adecuado. En términos de los efectos metabólicos en todo el cuerpo de la secreción de glucagón de los injertos, parece que la secreción de los injertos proporciona una protección mínima contra la hipoglucemia aguda (34), sin embargo, los trasplantes de islotes humanos pueden mantener niveles de glucosa casi normales. La secreción persistente de glucagón del páncreas puede hacer alguna contribución a la homeostasis de la glucosa, pero, de nuevo, poca protección contra la hipoglucemia aguda. Estas respuestas deficientes de glucagón podrían hacer que los receptores sean más propensos a la hipoglucemia durante el ejercicio (35,36), pero es poco probable que esto supere los beneficios. La siguiente pregunta es si hay alguna influencia local importante de las células no β de los islotes en la función de las células β. Teniendo en cuenta la anatomía microvascular de los islotes y los experimentos fisiológicos que muestran que las células no β están aguas abajo de las células β (13,14), parece probable que la mayoría de las células β no estén influenciadas por las células no β. Las mediciones que determinaron cuán lejos estaban las células β de las células no β pueden proporcionar cierta información. Cuando cuantificamos el número de células β que estaban muy cerca de una célula no β, se encontró que el 65-75% de las células β eran 50 µm de una célula no β. Parece poco probable que la secreción local de células no β pueda tener mucha influencia paracrina a esa distancia. Además, a partir de estudios de otros (37,38), sabemos que la microvasculatura de los islotes trasplantados es muy diferente de lo normal. Por lo tanto, la anatomía de los injertos de islotes es muy diferente de la de los islotes en el páncreas, sin embargo, estos injertos siguen siendo eficaces para revertir la hiperglucemia en receptores diabéticos.
En conclusión, encontramos que los agregados enriquecidos con células β pueden revertir efectivamente la hiperglucemia en ratones y que los islotes intactos trasplantados se agotan en células no β. Por lo tanto, es probable que las células no β de los islotes no sean esenciales para el trasplante exitoso de islotes.