hemoglobiinin affiniteetti Happeen kolmella rupikonnien alalajilla (Bufo sp.) elävät eri korkeuksissa
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratorio de Transporte de Oxígeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
abstrakti
veren hapen affiniteetti ja punasolujen ominaisuudet mitattiin kolmella bufo-suvun alalajilla: bufo spinulosus limensis, jotka kerättiin merenpinnan tasolta ja vuorokauden keskilämpötilan ollessa 20ºC; Bufo spinulosus trifolium, 3100 metristä, päivän keskilämpötila 15ºC; ja Bufo spinulosus flavolineatus, 4100 metristä, päivän keskilämpötila 10ºC. Hemoglobiinin elektroforeesi osoitti saman komponentin jokaisessa kolmessa alalajissa. 20ºC: n lämpötilassa veren happipitoisuudet (P50) osoittivat pieniä eroja Bufo spinulosus limensis-ja Bufo spinulosus trifolium-pitoisuuksien välillä, kun taas Bufo spinulosus flavolineatus-pitoisuuksien arvo oli selvästi pienempi. Bufo spinulosus flavolineatus-bakteerin Ympäristön lämpötila 10ºC: ssa P50 oli erittäin alhainen verrattuna kahteen muuhun alalajiin niiden vastaavissa ympäristön lämpötiloissa.
avainsanat: adaptaatiot, korkeus, sammakkoeläimet, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, hemoglobiiniaffiniteetti, hematokriitti, hapensidonta, rupikonnat
johdanto
Perussa Bufo-suvun kaltevuus vaihtelee merenpinnan tasosta yli 4000 metrin korkeuteen. Lajilla ”Bufo spinulosus” on kolme alalajia, joiden lokerot sijaitsevat matalalla, keskivaiheilla ja korkealla. Nämä alalajit ovat bufo spinulosus limensis (matala korkeus), Bufo spinulosus trifolium (keskikorkeus) ja Bufo spinulosus flavolineatus (12). Yksi intensiivisimmin tutkituista hengityselimistön ympäristösopeutumisista selkärankaisilla on hypoksia, jota esiintyy vaihtelevasti korkealla, alkion kehityksessä (esim.kohdussa) ja vesiympäristössä, erityisesti makeassa vedessä, ympäristöissä. Näihin sopeutumisiin liittyy yleensä muutoksia punasolujen ominaisuuksissa, hapenkantokyvyssä tai hemoglobiinin happiaffiniteetissa. Samalla eläimellä eri olosuhteissa tapahtuvat intraspesifiset adaptaatiot sisältävät yleensä muutoksia allosteerisissa tekijöissä (eli olosuhteissa, joissa hemoglobiini toimii punasolujen sisällä), kun taas eri lajeja vertailtaessa ilmenevät eri lajien väliset adaptaatiot johtuvat hemoglobiinimolekyylien ominaisuuksien muutoksista.
useimmat punasolujen ja hemoglobiinin ominaisuuksien hypoksisia adaptaatioita koskevat tutkimukset viittaavat kaloihin ja nisäkkäisiin, ja matalammista ektotermisistä selkärankaisista tiedetään hyvin vähän. Aiempi tutkimus osoitti, että Titicacajärven sammakko telmatobius culeus (2) eli 3800 metrin korkeudessa. sen veren O2-affiniteetti oli suurempi ja verisolut pienempiä kuin merenpinnan tasolla elävillä sammakoilla. Tämä tutkimus kuvaa bufon alalajien sopeutumista.
aineisto ja menetelmät
Bufo spinulosus limensis-alalajiin kuuluvat Anuraanit kerättiin rannikkotasangoilta noin 400 km: n päässä Laboratoriostamme Limassa (merenpinta, vuorokauden keskilämpötila 20ºC). Bufo spinulosus trifolium kerättiin Keski-Perun Andeilla (noin 3100 m, vuorokauden keskilämpötila 15ºC), ja Bufo spinulosus flavolineatus myös Keski-Andeilla (4100 m, vuorokauden keskilämpötila 10ºC). Eläimet tuotiin laboratorioomme muutamassa tunnissa. Verta vedettiin hepariiniruiskuissa aiemmin Pihtiputaalla eläneiden eläinten sydämistä. Bufo spinulosus limensis-lajista saatiin noin 3 ml verta ja muista alalajeista 1-1, 5 ml. Kahden-kolmen eläimen veri yhdistettiin määritysten tekemiseksi. Punasolujen määrä, hemoglobiinipitoisuus ja hematokriitti mitattiin tavanomaisilla menetelmillä.
hemoglobiinin elektroforeesi suoritettiin selluloosa-asetaattiliuskoilla hemoglobiinielektroforeesille ominaisessa puskurissa, ja nauhat värjättiin Ponceau S: llä ja luettiin tiheysmittarilla Helena Laboratoriesin (USA) käyttöohjeen mukaan.
veren ja hapen affiniteetti (P50) mitattiin sekoitustekniikalla (1,10) 10, 15 ja 20 asteen lämpötilassa. Veren tasapainotila määritettiin tonometrillä, joka säilytettiin näissä lämpötiloissa, käyttäen kaasuseoksia, jotka sisälsivät 4, 5% CO2: ta ja vaihtelevia O2-ja N2-pitoisuuksia. Veren O2-kylläisyys vaihteli 30-80% välillä. PH-mittari kalibroitiin korkean tarkkuuden fosfaattipuskureilla.
tasapainolämpötilojen pH-arvot (eq) laskettiin mittauslämpötilojen pH-arvoista (meas) käyttäen Rosenthalin (8) antamaa yhtälöä:
pHeq = pH meas + 0, 0147 (Teq _ Tmeas)
Bohr-tekijä saatiin muuttamalla veren pH: ta seuraavasti. Veren alikiintiöistä valmistettu Plasma joko hapotettiin maitohapolla tai emäksistettiin natriumhydroksidilla ja liuotettiin käyttövalmiiksi vastaavilla punasoluilla. Bufo spinulosus limensis-ja Bufo spinulosus trifolium-lajien verinäytteet tasapainotettiin 20 ja 15 asteeseen ja bufo spinulosus flavolineatus-lajien veri 20 ja 10 asteeseen ja eri pH-arvoihin Bohr-kertoimen laskemiseksi kullekin lämpötilalle (14). Tämä tekijä mahdollisti veren normaalin pH: n laskemisen kolmessa lämpötilassa. Mäen kertoimen (n) laskemiseksi käytettiin peräkkäisten likiarvojen menetelmää (10). Bohrin yhtälöstä kullekin alalajille laskettiin arvo erillisissä kokeissa saaduista tiedoista.
van’ t Hoffin yhtälöllä laskettiin hapetuksen kokonaislämpö DH ’ P50-arvoista. Bufo spinulosus limensis-bakteerille käytettiin arvoja 20ºC ja 15ºC, kun ympäristön lämpötila oli 20ºC. Bufo spinulosus trifoliumille käytettiin arvoja 15ºC ja 20ºC, kun ympäristön lämpötila oli 15ºC. Bufo spinulosus flavolineatus – valmisteelle käytettiin arvoja 10ºC ja 20ºC, kun ympäristön lämpötila oli 10ºC. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin opiskelijan t-testillä, jossa käytettiin Windowsille tarkoitettua Systat 6.0-ohjelmistoa.
tulokset
taulukot I ja II tiivistävät hematologiset tiedot. Bufo spinulosus limensis-ja Bufo spinulosus trifolium-lajien arvojen välillä ei ole tilastollista eroa. Arvot hematokriitti, hemoglobiini, ja määrä RBC Bufo spinulosus flavolineatus ovat paljon pienempiä.
elektroforeesikokeet osoittivat samat siirtymäetäisyydet kunkin kolmen alalajin hemoglobiineissa ja kahden kaistan esiintyminen joissakin juoksuissa (Fig. 4). Muita tutkimuksia hemoglobiinin ominaisuuksien määrittämiseksi ei tehty.
taulukossa II esitetään veren hemoglobiinin toiminnalliset ominaisuudet, ja P50: ssä on pieniä eroja Bufo spinulosus limensis-ja Bufo spinulosus trifolium-arvojen välillä, kun taas Bufo spinulosus flavolineatus-arvojen arvo on pienempi. Arvot ympäristön lämpötilassa, josta eläimet kerättiin, eivät poikenneet merkittävästi Bufo spinulosus limensis-ja Bufo spinulosus trifolium-arvojen välillä. Bufo spinulosus flavolineatus-lajin P50-arvo on hyvin alhainen 10ºC: ssa. Kuvassa 1 on log P50 vs. pH. kuvassa 2 on hemoglobiinin happi dissosiaatiokäyrät, jotka on rakennettu P50: n arvoilla ja Hillin kertoimella 20º C. Bufo spinulosus limensis-ja Bufo spinulosus trifolium-käyrät ovat hyvin lähellä toisiaan, kun taas Bufo spinulosus flavolineatus-käyrä on siirretty vasemmalle. Kuva 3 kuvaa veren O2-pitoisuutta vs. veren PO2-pitoisuutta kunkin alalajin ympäristön lämpötilassa. Tämä osoittaa Bufo spinulosus flavolineatus-bakteerin alhaisen O2-pitoisuuden ja erittäin alhaisen P50-pitoisuuden sekä sen, että Bufo spinulosus trifolium-bakteeri siirtyy kohtalaisesti vasemmalle bufo spinulosus limensis-bakteeriin verrattuna, eikä veren O2-pitoisuutta ole vähennetty bufo spinulosus limensis-ja Bufo spinulosus trifolium-bakteereissa.
Kuva. 1: Bohr-efekti kolmessa Bufo spinulosuksen alalajissa. Bufo spinulosus flavolineatus näyttää suurimman Bohr-tekijän.
Kuva. 2: Veridissosiaatiokäyrä kolmelle alalajille pH: ssa 7,84 ja 20º C. Bufo spinulosus flavolineatus-lajin käyrä siirtyy vasemmalle.
Kuva. 3: hemoglobiini O2 pitoisuus vs osittainen happipaine kunkin subspeceis vastaa ekologinen lämpötila. Bufo Spinulosus limensis (20º C), Bufo spinulosus trifolium (15º C) Bufo spinulosus flavolineatus (10º C). Bufo spinulosus flavolineatus-lajin hemoglobiinipitoisuus on pienempi kuin kahdella muulla alalajilla ja P50 on hyvin alhainen.
Kuva. 4: Bufo Spinulosuksen kolmen alalajin elektroforeesi. Koe osoittaa samat vaellukset etäisyydet hemoglobiinit kunkin kolmen alalajia ja läsnäolo kaksi bändejä joissakin kulkee.
nämä tulokset osoittavat, että 20ºC: ssa Bufo spinulosus flavolineatus, jonka luonnollinen elinympäristö on lähellä 4000 metriä ja jonka Ympäristön lämpötila on keskimäärin 10ºC, on alhainen hemoglobiinipitoisuus ja korkea hemoglobiinin affiniteetti verrattuna Bufo spinulosus trifoliumiin, jonka ympäristön keskimääräinen korkeus on lähellä 3000 metriä ja jonka ympäristön keskilämpötila on 15ºC. Bufo spinulosus limensis (merenpinta) ja Bufo spinulosus trifolium olivat lähes identtiset käyrät. Jos käyrät saatiin ympäristön lämpötilassa, Bufo spinulosus flavolineatus osoitti hyvin alhaisen O2-pitoisuuden ja korkean hemoglobiiniaffiniteetin verrattuna kahteen muuhun alalajiin. Bufo spinulosus flavolineatuksessa korkea DH ’ osoittaa hemoglobiinin affiniteetin suurta herkkyyttä ympäristön lämpötilan muutoksiin, ja korkea Bohr-tekijä osoittaa myös hemoglobiinin affiniteetin suurta herkkyyttä veren pH: n muutoksiin.
keskustelu
Bufojen suku on laajalle levinnyt Andien maissa. Bufo spinulosuksella on kolme alalajia, joiden kapeikot sijaitsevat Andien alavilla rinteillä, välilaaksoissa (3000 m) ja korkeimmilla tasangoilla (yli 4000 m). Keskikorkeuden alalaji Bufo spinulosus trifolium ja merenpinnan tason alalaji Bufo spinulosus limensis eivät eroa hematologisilta arvoiltaan. Korkealla elävällä Bufo spinulosus flavolineatuksella hemoglobiinipitoisuus on paljon pienempi, mutta punasolujen ominaisuudet ovat samanlaiset kuin kahdella muulla alalajilla. RBC näyttää olevan pienempi kuin kahden muun alalajin, toisin kuin Ruizin (9) havainnot, jotka osoittivat päinvastaista. Tiedetään, että Bufo-suvun hemoglobiinipitoisuus on korkeampi kuin muilla sammakkoeläimillä. Hutchinson ja szarki (3) pitävät tätä korkean verisuonituksen ja maanpäällisen tavan syynä. Bufo spinulosus flavolineatus-bakteerin hemoglobiinipitoisuus on kuitenkin hyvin alhainen.
kolmessa ryhmässä hemoglobiinielektroforeettisessa tutkimuksessa nähdään henkilöitä, joiden elektroforeettisessa rakenteessa esiintyy kaksi selvästi erillistä hemoglobiiniryhmää. Bufo spinulosus trifolium-ja Bufo spinulosus limensis-hemoglobiinin affiniteetissa ei ole eroa 20ºC: ssa, kun taas Bufo spinulosus flavolineatus-bakteerissa se on korkeampi. Kun affiniteetteja tutkittiin ympäristön lämpötiloissa, joissa eläimet elävät, Bufo spinulosus trifoliumilla oli happidissosiaatiokäyrät, jotka siirtyivät kohtalaisesti vasemmalle Bufo spinulosus limensis-bakteerista, ja Bufo spinulosus flavolineatus osoitti hyvin huomattavaa muutosta, mikä viittaa erittäin korkeaan hemoglobiinin affiniteettiin.
korkealla elävillä nisäkkäillä ja linnuilla on yleensä korkea veren happiherkkyys, eikä niillä esiinny polysytemiaa korkealla (5). Olisi mielenkiintoista seurata, onko ulkotermisissä eläimissä näitä reaktioita ympäristön hypoksiaan ja kylmiin olosuhteisiin. Teoriassa kylmien olosuhteiden pitäisi auttaa lisäämään sietokykyä korkealle, koska se hidastaa aineenvaihduntaa. Kun kyseessä on Bufo spinulosus flavolineatus, jonka päivälämpötila kivien alla 4100 metrin korkeudessa on noin 10ºC ja yöllä noin 6ºC tai vähemmän lammikoissa, joissa ne lepäävät puoliksi upotettuina, suuri affiniteetti osoittaa valintapaineen kohti hypoksiaa, vaikka aineenvaihdunta saattaa hidastua. Packard ja Stiverson (7) eivät löytäneet yhteyttä korkeuden ja hemoglobiinipitoisuuden välillä kuorosammakolla (Pseudacris triseriata), mutta korkeusvaihtelu heidän tutkimuksessaan (1500 m ja 3000 m) oli pieni.
hemoglobiinin affiniteetti on selkärankaisilla ilmeisesti hypoksisen ympäristön valitsema geenimerkki. Nisäkkäillä ja linnuilla affiniteetti on melko kiinteä ominaisuus, joka ei lisäänny hypoksiassa eikä häviä normoxiassa (6). Kaloilla taas veren happi lisääntyy selvästi hypoksian aikana (13).
vertailunäkökulmasta ektotermien ja endotermien välillä on joitakin yhtäläisyyksiä. On havaittu, että hemoglobiinin affiniteetin ja korkeuden välillä on jonkinlainen korrelaatio niiden hiirten alalajeissa, joilla on korkeusgradientti (11). On myös osoitettu, että saman nisäkäslajin sisällä, joka elää Andeilla pystysuoraa gradienttia pitkin, korkeimman alueen yksilöillä on hemoglobiineja, joilla on suurempi affiniteetti kuin alimmalla alueella elävillä yksilöillä. Erot olivat suuremmat Andien ketun tapauksessa ,jossa kaksi erillistä lajia ovat korkeusalueen kahdessa ääripäässä (4).
tämä teos vahvistaa käsitystä, jonka mukaan polysytemiaa ei valita hypoksisen ympäristön adaptiiviseksi parametriksi. Päinvastoin, korkean affiniteetin hemoglobiini näyttää olevan vahvasti valikoitunut monilla korkealla elävillä eläimillä.
tunnustukset
Kiitämme tohtori Roy E. Weberiä avusta, jolla hän selvensi ajatteluamme tästä aiheesta, sekä käsikirjoituksen tarkistamisesta.
Vastaava Tekijä: Hrvoj Ostojic P.-Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Puhelin: (56-57) 420599, faksi: (56-57) 427683, Sähköposti: [email protected]
vastaanotettu: 13. elokuuta 1999. Hyväksytty tarkistetussa muodossa: 6. toukokuuta 2000
bibliografia
1. EDWARDS MJ, MARTIN RJ (1966). Sekoitustekniikka happi-hemoglobiini-tasapainoon ja Bohr-vaikutukseen. J Appl Physiol 21:1898-1902
2. HUTCHINSON VH, HAINES HB, ENGEBRETSON G (1976) Aquatic life at high altitude: Respiratory adaptations in the Lake Titicaca frog, Telmatobius culeus. Respir Physiol 2: 115-119.
3. HUTCHINSON VH, SZARSKI H (1965) erytrosyyttien määrä joissakin sammakkoeläimissä ja matelijoissa. Copeia: 373-375
4. LEON-VELARDE F, DE MUIZON C, PALACIOS JA, CLARK D, MONGE-C C (1996) Hemoglobin affinity and structure in high-altitude and sea-level carnivores From Peru. Comp Biochem Physiol 113A:407-411
5. MCCUTCHEON FH HALL FG (1937) hemoglobiini Amfibiassa. J-Solu & Comp-Fysioli 9:191-197
6. MONGE C, LEON-VELARDE F (1991) Physiological adaptation to high altitude: oxygen transport in mammals and birds. Physiol Rev 71: 1135-1172
7. PACKARD G C STIVERSON RK (1976) veren hemoglobiinipitoisuus kuorosammakossa (Pseudacris triseriata): suhde ruumiin kokoon ja korkeuteen. Am Midl Nat 96: 482-487
8. ROSENTHAL TB (1948) the effect of temperature on pH of blood and plasma in vitro. J Biol Chem 173:25-30
9. RUIZ G, ROSENMANN M, VELOSO A. (1989) Altitudinal distribution and blood values in the toad, Bufo spinulosus Wiegmann. Comp Biochem Physiol 94A: 643-646
10. SCHEID P, MEYER M (1978) Mixing technique for study of oxygen-hemoglobin equilibrium: a critical evaluation. J Appl Physiol 45: 818-822
11. SNYDER GK, BLACK CP, BIRCHARD GF (1982) Development and metabolism during hypoxia in pricies of high altitude Anser indicus versus sea level Branta canadensis hanhet. Physiol Zool 55:113-123
12. VELLARD J (1959) Estudios sobre batracios andinos V: el género Bufo. Mem Hist Nat Javier Prado Nº 8
13. WEBER RE (1992) Molecular strategies in the adaptations of vertebrate hemoglobin function in: WOOD SC, WEBER RE, HARGENS AR, MILLARD RW (eds) Physiol adaptations in vertebrates, New York: Marcel Dekker
14. WINSLOW RM, MORRISSEY JM, BERGER RL, SMITH PD, GIBSON CC (1978) Variability of oxygen affinity of normal blood: an automated method of measurement. J Appl Physiol: Respirat Environ Exercise Physiol 45 (2): 289-297