Poissonin jakauma, joka on nimetty ranskalaisen matemaatikon Siméon Denis Poissonin mukaan, on tietyn tapahtumamäärän esiintymistodennäköisyys tietyllä (kiinteällä) ajanjaksolla, jos tapahtumat tapahtuvat vakionopeudella (tiedossa) ja ovat riippumattomia edellisen tapahtuman esiintymisestä. Se perustuu diskreettiin todennäköisyysjakaumaan, jossa tulosten joukko on diskreetti tai äärellinen, kuten kolikon heitto tai nopanheitto.
digitaalisen PCR-kokeen yhteydessä diskreetti tulos on kohdegeenin läsnäolo tai puuttuminen. Digitaalista PCR-reaktiota varten tuotettujen tuhansien yksittäisten osioiden oletetaan noudattavan Poisson-jakaumaa ottaen huomioon, että osiot ovat monodispersioituneita ja ne sisältävät vastaavan määrän näyteseosta.
jos nämä parametrit eivät täyty ja osiot ovat polydispersiivisiä, osioiden näyteseoksen tilavuus vaihtelee suuresti ja suuremmissa osioissa voi olla enemmän kohteita kuin pienemmissä, mikä heikentää digitaalisen PCR-reaktion tarkkuutta.
tässä kohdassa käydään läpi Poissonin lain matemaattinen laskenta digitaalista PCR-koetta varten.
digitaalisessa PCR-kokeessa kaivo, joka sisältää ositetun näytteen ja kohdegeenin kvantifioitavaksi, on ensin määriteltävä seuraavat muuttujat:
- \(n\): analysoitavien osioiden kokonaismäärä kaivossa
- \(p\): kohdegeenin positiivisten osioiden lukumäärä
- \(v\): partition tilavuus (µL), jonka oletetaan olevan vakio
- \(d\): laimennuskerroin, jota käytetään näytteen laimentamiseen varastosta kaivoon
(esim. \(d=10\) tarkoittaa, että näyte on laimennettu 10 kertaa)
ja sitten nämä ylimääräiset:
-
\(V = n \ v\): koko osio tilavuus ruiskutetaan hyvin
-
\( _ {0}\) : kohdegeenien pitoisuus kaivossa (kopioina / µL)
-
\(C = d \ C_{0}\): kohdegeenien pitoisuus kannassa (kopioina / µL)
-
\(\lambda = c_{0} \ v\): kohdegeenien keskimääräinen lukumäärä kaivon osiota kohti
kohdegeenien jakauma, joka on kapseloitu kaivon osioihin, seuraa parametrin \(\lambda\) Poisson-jakaumaa :
Proba ( partition kapseloi \(\text{$k$}\) kohdegeenit ) \(= \dfrac{\lambda^k}{k!} e^{- \lambda}\)
sanotaan osio:
-
”positiivinen osio” jos se on kapseloinut vähintään 1 kohdegeenin (jolloin havaitsemme fluoresoivan osion vahvistusprosessin päätepisteessä, joten suurin osa epävarmuudesta on tässä” ainakin yhdessä ” tilassa)
-
”negatiivinen partition” if on kapseloinut 0 kohdegeenin (jolloin havaitsemme ei-fluoresoivan partition amplifikaatioprosessin päätepisteessä)
positiivisten osioiden jakauma kaivossa seuraa todennäköisyyden binomijakaumaa \(1 – e^{- \lambda}\):
- todennäköisyys (hyvin Sisältää \(\text{$p$}\) positiiviset osiot \(= {\RM C}_{n}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{n-p} \)
- todennäköisyys (partition is negative) \( = e^{-\lambda} \)
- todennäköisyys (partition is positive) \( = 1 – e^{-\Lambda} \)
Jos \(n\) on riittävän suuri:
- Proba (partition is positive) \ (=\dfrac{p}{N} \)
arvioidun kantapitoisuuden kaava on siis:
\ (C = – \dfrac{d}{v} \ Ln{\left (1 – \dfrac{p}{n} \right)} \)
jos sinun on automaattisesti laskettava kohdegeenien arvioidut pitoisuudet sekä niiden luottamusväli ja suhteellinen epävarmuus, käytettävissä on verkkotyökalu: Poisson Law: Going Further. Kokeile!
lisätietoja epävarmuuskäyristä sekä havaitsemis – ja kvantifiointirajoista on kohdassa dynaamiset Havaitsemisalueet & kvantifiointi.