A conceptual and practical overview of cDNA microarray technology: implications for basic and clinical sciences

Braz J Med Biol Res, octobre 2005, Volume 38 (10) 1543-1552 (Review)

A conceptual and practical overview of cDNA microarray technology: implications for basic and clinical sciences

V. de Mello – Coelho et K.L. Hess

Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brésil

Résumé
Texte

Correspondance et notes de bas de page

Résumé

Le microarray d’ADNc est une technologie innovante qui facilite l’analyse de l’expression de milliers de gènes simultanément. L’utilisation de cette méthodologie, qui évolue rapidement, nécessite une combinaison d’expertise des sciences biologiques, mathématiques et statistiques. Dans cette revue, nous tentons de donner un aperçu des principes de la technologie des puces à adn, des préoccupations pratiques du traitement analytique des données obtenues, de la corrélation de cette méthodologie avec d’autres méthodes d’analyse de données telles que l’immunohistochimie dans les puces à adn tissulaires et de l’application des puces à ADN dans des domaines distincts des sciences fondamentales et cliniques.

Mots clés: Biotechnologie, microarray d’ADNc, Expression génique, génomique

Introduction

Les gènes sont des unités héréditaires formées par des séquences d’acide désoxyribonucléique (ADN) organisées en chromosomes dans le noyau cellulaire. Le processus complexe de transcription à partir de ces séquences entraîne la génération d’acides ribonucléiques messagers (ARNm). Ces ARNm codent pour des protéines, qui sont composées d’acides aminés, et remplissent la fonction désignée du gène (1). Ainsi, les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des cellules et des tissus sont déterminées par l’expression simultanée, sélective et différentielle de milliers de gènes.

Depuis la dernière décennie, des études impliquant la cartographie des gènes, le clonage et le séquençage ont fourni des informations importantes pour l’analyse structurale de génomes distincts (2,3). La quantité d’informations obtenues à partir de ces enquêtes nécessite l’organisation des données acquises. Pour répondre à ce besoin, des bases de données publiques ont été créées pour stocker des millions de séquences de gènes et d’étiquettes de séquences exprimées (EST), permettant l’adhésion à des séquences de gènes pour l’analyse des similitudes ainsi que des différences entre les génomes d’espèces distinctes (4).

Les études structurelles des génomes ont soulevé de nombreuses questions liées à la compréhension fonctionnelle et régulatrice des profils d’expression génique dans des types cellulaires et des tissus distincts de divers organismes (3,5,6). La technologie des puces à ADN a été développée pour étudier le traitement biologique complexe impliquant plusieurs milliers de gènes (7,8). L’une de ces technologies de microréseaux utilise des brins ou des sondes d’ADN simples (oligomères) qui sont imprimés sur une surface de verre à l’aide de la photolithographie (9). Une autre méthodologie de microréseaux d’ADN, qui est au centre de la présente revue, est la technologie de microréseaux d’ADN complémentaire (ADNc) (10). Avec ces méthodologies, il est possible 1) de comparer simultanément le modèle d’expression dynamique de milliers de gènes dans des cellules ou des tissus, 2) de détecter des différences moléculaires au cours de différentes étapes des processus cellulaires, par exemple, la différenciation, la prolifération et l’induction de l’apoptose, 3) d’identifier des différences transcriptionnelles entre les états non malades et pathologiques, 4) d’identifier les changements dans les cellules dus à une réponse médicamenteuse, et 5) d’identifier de nouveaux biomarqueurs pouvant être utilisés dans le diagnostic, le pronostic et le traitement clinique des maladies.

Les principes de la technologie des puces à adn CDN

Une méthodologie classique utilisée pour la détection et la quantification de l’ARNm dans une cellule donnée est appelée analyse Northern blot (11). Le principe principal de l’analyse Northern blot est l’hybridation d’une sonde spécifique à un gène radiomarqué à un ARNm lié à un filtre, afin de déterminer si ce gène est présent. Une autre méthode utilisée pour détecter l’expression d’un gène spécifique est la réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse (RT-PCR). La RT-PCR implique l’utilisation d’amorces spécifiques au gène et de transcriptase inverse pour synthétiser une séquence d’ADNc en ARNm. L’ADNc est ensuite amplifié par plusieurs cycles de transcription médiée par la polymérase de cet ADNc modèle (12). Il existe plusieurs types de RT-PCR et le plus précis en termes de quantification est la méthode de RT-PCR en temps réel, qui nécessite un système automatisé capable de détecter la fluorescence induite lors de la réaction de RT-PCR (12). Au cours de la RT-PCR, l’expression d’un certain gène peut être déduite en le comparant à des gènes exprimés de manière constitutive, également appelés gènes de « ménage ».

La technologie de microarray d’ADNc, qui analyse simultanément les niveaux d’expression génique de milliers de gènes, repose sur les mêmes principes que ceux des analyses Northern blot et RT-PCR (7,8). Essentiellement, le microarray d’ADNc est l’hybridation de milliers de gènes d’ADNc à leurs cibles correspondantes sur une puce ou un filtre. Cependant, le défi actuel de cette technologie est d’analyser les quantités substantielles de données numériques brutes obtenues par l’acquisition de signaux d’hybridation (13). Des analyses computationnelles et biostatistiques sont nécessaires pour traiter avec précision des données significatives pour les objectifs spécifiques de l’enquête (figure 1).

Produire une matrice de puces à adn CDN

Récemment, plusieurs entreprises ont conçu des puces à adn CDN axées sur des systèmes de profils d’expression génique spécifiques. Ces matrices sont disponibles dans le commerce par les sociétés de biotechnologie, y compris SuperArray Bioscience Corporation et Affymetrix, pour une utilisation à des prix abordables. Dans cette section, nous tentons de décrire les étapes de base de la production d’une matrice de microréseaux d’ADNc.

La première étape de production d’une matrice de microréseaux d’ADNc est la sélection et l’amplification de fragments totaux ou partiels de séquences d’ADNc à imprimer sur des substrats, qui seront ensuite hybridés avec des séquences d’ADNc cibles (14,15). Les méthodes les plus courantes de sélection des séquences sont basées sur les ressources suivantes: 1) des banques de données génétiques telles qu’Unigene, dbEST et GenBank, qui donnent des informations sur la fonction du gène spécifique et la localisation des chromosomes; 2) des collections de clones ou des séquences d’ADNc disponibles dans les pages d’accueil de sites Web d’entreprises commerciales; 3) des constructions sur mesure de bibliothèques d’ADNc à partir de cellules ou de tissus cibles précédemment clonées et séquencées pour l’identification de l’EST. Une fois sélectionnés, les fragments d’ADNc sont amplifiés par PCR sur des microplaques multicellulaires, purifiés par précipitation chimique, puis examinés pour la qualité et la quantité par électrophorèse sur gel. Les produits PCR sont imprimés sur une lame ou une membrane à l’aide d’une machine robotique, le microarrayer. Lors de l’impression ou du dépôt robotisé de l’ADN, les tubes capillaires reçoivent une pression constante et déposent en série l’ADN sur la lame ou la membrane, créant ainsi une conception de « microréseau » (16). Différents types de substrats, y compris des lames de verre et des membranes en nylon, sont prétraités pour augmenter leurs charges hydrophobes, ce qui entraîne une augmentation de l’adhérence totale des séquences d’ADN aux substrats (13). Plus important encore, l’indexation des données contenant l’emplacement de milliers de clones d’ADNc imprimés sur les substrats est effectuée par un étiquetage prudent de chaque microplaque à l’aide d’un logiciel conçu pour l’analyse de bases de données. Cette base de données comprend également l’identité du clone (ID du clone), le nom du gène, l’emplacement du chromosome et la ou les fonctions du gène.

L’hybridation de la sonde d’ADNc avec la matrice de microréseaux d’ADN cible

Un facteur crucial pour une hybridation réussie de la sonde d’ADNc avec la matrice de microréseaux d’ADN cible repose sur la qualité de l’ARNm provenant de cellules ou de tissus. Les contaminants de l’ARN de la sonde avec de l’ADN génomique, des protéines ou des résidus de détergent peuvent entraîner des données faussement positives / faussement négatives.

Le marquage de la sonde lors de la synthèse de l’ADNc par transcription inverse des séquences d’ARN dépend du type de microréseau d’ADNc utilisé (16). En général, lorsque l’analyse de microréseaux d’ADNc est effectuée en utilisant des membranes en nylon comme substrat, l’ARN sonde est marqué radioactivement par incorporation de nucléotides dCTP-P33 au cours du processus de transcription inverse (7). Dans le cas d’une puce ADNc imprimée sur des lames de verre, on utilise des nucléotides radioactifs (17) et des colorants fluorescents à taux d’incorporation élevés, tels que les cyanines Cy-3 dUTP et Cy-5 dUTP (8). Pour plus d’informations sur les types de micro-réseaux d’ADNc et le processus d’hybridation (7,8,17-20), voir le tableau 1.

Outils d’analyse pour l’identification des modèles d’expression génique à l’aide de la technologie des puces d’ADNc

Des outils pour l’analyse des quantités massives de données générées à partir des puces d’ADNc sont encore en cours de développement. Actuellement, les chercheurs analysent les données de microréseaux d’ADNc à l’aide de divers logiciels (21-24). Cela signifie qu’il n’existe pas de méthode unique pour analyser la quantité massive de données obtenues à l’aide de cette technologie. L’utilisation d’outils biostatistiques est devenue de plus en plus importante dans l’analyse de la signification des profils d’expression génique.

Pour donner une idée générale de certains des types de méthodes utilisées pour analyser les données de microréseaux d’ADNc, nous décrirons et discuterons des étapes qui pourraient entraver le processus d’analyse. De la plus haute importance est la validation des résultats en complétant plusieurs expériences répliquées. Après acquisition des signaux d’hybridation, les substrats sont examinés visuellement à l’aide de programmes de calcul. Dans ce cas, la qualité des substrats est prise en compte. Par exemple, les images de taches floues, les précipités de colorant ou les échantillons avec de forts signaux de fond sont généralement rejetés. Cette analyse est importante pour éliminer les artefacts, ce qui peut entraîner la détection de signaux faussement positifs (16). Divers chercheurs appliquent la méthode de soustraction en arrière-plan des signaux d’hybridation aux signaux non spécifiques en arrière-plan. Dans cette étape, en fonction du logiciel utilisé, il est possible de soustraire les signaux d’arrière-plan des deux manières suivantes: 1) par la moyenne arithmétique ou médiane résultant de l’intensité du signal entre les signaux positifs de taches dans le substrat, ou 2) par la moyenne arithmétique ou médiane du signal non spécifique, telle que l’intensité du signal résultant de la zone immédiate autour de chaque tache correspondent à un signal génétique spécifique. Par ces deux méthodes, les valeurs moyennes ou médianes arithmétiques sont soustraites du signal positif représentant un gène exprimé différentiellement (16). L’acquisition de l’intensité du signal positif dans des grilles de localisation créées à l’aide d’un logiciel spécifique est complétée par des valeurs arbitraires appelées algorithmes. Ces valeurs sont accessibles directement dans le logiciel de base de données, qui contient des informations préalablement cataloguées de chaque gène imprimé sur le substrat.

En raison de l’énorme quantité de gènes analysés simultanément et de la variabilité de toutes les étapes techniques de la technique de microréseau d’ADNc, il est important de créer un facteur d’ajustement ou de compensation, ce qui se fait par un processus de normalisation des données. L’existence de signaux non spécifiques sur les substrats, des problèmes liés à la quantité ou à la qualité de l’ARN avant l’hybridation, ou la variabilité de l’incorporation de l’ARN par sonde peuvent tous entraîner une altération de la normalisation de l’échantillon (14,16). Pour une interprétation plus significative des données, le processus de normalisation effectue une analyse comparative de la moyenne arithmétique des algorithmes d’un groupe individuel avec un autre, fréquemment choisi comme contrôle (24,25). Il existe plusieurs types de méthodes de normalisation et la sélection de la méthode la plus appropriée peut être un défi. La raison en est que de multiples variables expérimentales empêchent souvent l’identification précise des gènes exprimés différentiellement sans que les résultats faussement positifs / faussement négatifs ne contaminent l’évaluation des données. Le support mathématique, statistique et bioinformatique est essentiel à ce stade de la technologie des puces à adn CDN.Les méthodes de normalisation

comprennent: 1) le rapport logarithmique des niveaux d’expression mesurés entre groupes distincts sur la base de la moyenne, de la médiane, des différences médianes ou de la variance obtenues à partir de tous les signaux positifs situés sur les substrats; 2) l’analyse de régression, qui est évaluée à travers le coefficient de corrélation ou la distance euclidienne, et est basée sur la distribution représentée par les algorithmes correspondent aux intensités de signal dans les échantillons distincts du même groupe, et 3) des tests statistiques tels que le test t ou l’analyse associative, qui considèrent des comparaisons appariées multiples basées sur le seuil significatif de P < 0,05 et la correction de signification du seuil du test t, respectivement (25,26). De plus, la méthode de normalisation de régression linéaire pondérée localement (lowess), fréquemment utilisée pour les réseaux fluorescents, tient compte des variations décroissantes des signaux d’hybridation d’intensité et de la localisation spatiale de l’ADNc repéré sur la lame (27).

Après normalisation, la méthode la plus simple pour identifier les différences entre les modèles d’expression génique consiste à utiliser la différence de rapport entre un échantillon et son contrôle approprié. Dans ce cas, une limite arbitraire est établie et à partir de cette valeur, il est possible de sélectionner les gènes exprimés différentiellement à l’aide d’un logiciel de base de données. Par exemple, il est possible d’établir un seuil de 2 fois pour identifier les gènes présentant des changements significatifs de niveau d’expression. Au cours de ce processus, les gènes de cette gamme seront sélectionnés et organisés dans des tableaux situés dans la base de données. Les gènes répondant aux critères de sélection peuvent être visualisés à partir de bases de données à l’aide d’un logiciel qui montre des cartes auto-organisatrices (28,29). De plus, ces changements dans les profils d’expression génique entre groupes distincts peuvent être visualisés dans des dendrogrammes basés sur une analyse de regroupement hiérarchique (25,29,30). Dans ce cas, les gènes régulés vers le bas sont généralement représentés en vert et les gènes régulés vers le haut sont généralement représentés en rouge. Comme la différence de régulation génétique est plus intense, sa couleur respective l’est également. Des logiciels permettant d’analyser les données de microréseaux d’ADNc sont disponibles via Internet.

Il est important de noter que l’analyse des profils d’expression génique acquis par la technologie des microréseaux d’ADNc implique l’analyse simultanée de milliers de gènes. Avant d’effectuer des études physiologiques de gènes sélectionnés, les résultats de la microréseau d’ADNc doivent être confirmés au niveau de l’ARN par analyse Northern blot ou RT-PCR en temps réel (14). Cela élimine la possibilité de résultats de microarray d’ADNc faussement positifs dus à l’hybridation croisée entre des gènes d’une même famille de gènes. Une confirmation supplémentaire est également fortement recommandée au niveau des protéines, par exemple par analyse Western blot, cytométrie en flux ou immunohistochimie. Dans ce contexte, il est actuellement possible d’évaluer des gènes au niveau des protéines à l’aide de tests de microréseaux tissulaires (31-33). Le dosage des microréseaux tissulaires est une méthode qui permet d’évaluer jusqu’à mille tissus à la fois à l’aide d’un marqueur spécifique. Fondamentalement, de petites biopsies à noyau de 1 mm ou moins sont isolées de blocs de tissus individuels noyés dans de la paraffine avec un dispositif métallique spécial ou une aiguille, et placées dans un autre bloc de paraffine de manière rangée. Les avantages de cette technique sont: 1) l’économie et la conservation des échantillons de tissus originaux obtenus pour la biopsie pour construire le réseau; 2) pour éviter les problèmes techniques puisque le réseau est construit dans une seule lame de verre, facilitant ainsi les processus techniques de lavage et de coloration, et 3) la rapidité pour effectuer des analyses in situ simultanément dans plusieurs échantillons de tissus à la fois. Cliniquement, il s’agit d’une technique puissante à utiliser conjointement avec l’analyse de microréseaux d’ADNc pour identifier de nouveaux biomarqueurs susceptibles d’être utilisés comme outils diagnostiques, pronostiques et thérapeutiques contre des conditions pathologiques (31,32).

Technologie des puces ADNc: applications et perspectives

En termes d’application, la technologie des puces à adn conduit à l’identification de gènes spécifiques et permet aux chercheurs de comparer les profils d’expression des gènes dans des conditions normales et pathologiques chez divers organismes. En science fondamentale, le microarray d’ADNc a été utilisé pour identifier le rôle de plusieurs gènes impliqués dans des processus cellulaires, tels que la différenciation cellulaire, grâce à la comparaison des modèles d’expression génique entre des cultures cellulaires normales et transfectées, par exemple (34). De nombreux groupes de recherche ont utilisé la technologie des puces à adn CDN pour étudier différents types de cancers ainsi que la pathogenèse des maladies infectieuses (35-40). Dans ce cas, l’identification de nouveaux gènes ou de changements dans les schémas d’expression des gènes dans les tissus de l’état non malade à l’état malade a contribué à mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant l’apparition et la progression des maladies. De plus, le microarray d’ADNc a été considéré comme une méthodologie très intéressante dans l’industrie pharmaceutique. Dans ce contexte, l’analyse du profil d’expression génique à grande échelle de cellules soumises à des tests de médicaments distincts pourrait être pertinente pour classer les agents potentiels à usage thérapeutique (41). Plusieurs exemples d’application de la méthodologie des puces à adn CDN en sciences fondamentales et cliniques (34-48) sont décrits dans le tableau 2.

L’analyse de microréseaux d’ADNc est une méthodologie coûteuse, mais l’abondance des résultats générés par cette technologie est un gain incontestable. Une fois qu’une unité centrale de recherche est organisée pour le développement de cette méthodologie, divers chercheurs peuvent profiter de l’avantage d’utiliser des substrats de microréseaux d’ADNc précédemment imprimés pour étudier les gènes exprimés de manière différentielle dans les domaines biologiques et cliniques. Pour l’organisation des unités de microréseaux d’ADNc, l’interaction multidisciplinaire entre les arènes mathématiques et biologiques doit être prise en compte. Un modèle schématique hypothétique simple démontrant l’infrastructure d’une unité de microréseau ADNc est illustré à la figure 2.

Enfin, des banques centralisées contenant des données de profils d’expression génique analysés par la technologie des puces à adn cDNA ont été créées et sont disponibles pour inspection via Internet (49,50). De cette manière, différents groupes du monde entier pourront comparer des données de profils géniques sélectionnés avec d’autres déposées dans des banques de données moléculaires telles que Gene Expression Omnibus ou Array Express, conçues par l’Institut européen de Bioinformatique (51).

Un problème qui a restreint une interaction bénéfique entre divers groupes de recherche utilisant la technologie des puces à adn CDNA est le manque de normes pour la présentation et l’échange des résultats. Pour compenser cette situation difficile, l’Information Minimale pour l’Annotation d’une Expérience de Microréseau (MIAME) a été créée (52). Des lignes directrices menant à la normalisation des expériences de microarray d’ADNc ont été proposées par la Micro-array Gene Expression Data Society (MGED). MIAME est essentiellement composé de six sections: 1) conception expérimentale; 2) conception de tableaux; 3) échantillons utilisés, préparations d’extraction et hybridation; 4) procédures et paramètres d’hybridation; 5) image, quantification et mesure des paramètres, et 6) types, valeurs et spécifications pour les contrôles de normalisation. MIAME est devenu une exigence pour publier les résultats de microarray d’ADNc dans de nombreuses revues scientifiques. De plus, des groupes distincts, dont MGED, Rosetta, Agilent et Affymetrix, ont travaillé ensemble en utilisant la bioinformatique pour concevoir l’expression génique des puces à adn (MAGE), une plate-forme à structure flexible commune qui permet la communication entre différents groupes de recherche utilisant la technologie des puces à adn CDN. MAGE est composé des éléments suivants : 1) MAGE-ON (modèle objet), un modèle de données centré qui utilise un langage de modélisation unifié et implémente les exigences MIAME; 2) MAGE-ML (markup language), qui documente la traduction de MAGE-OM vers un format de données basé sur XML, et 3) MAGE-SLK, un logiciel librement accessible qui définit l’interface des programmeurs d’applications avec MAGE-OM, permettant ainsi l’exportation de données vers MAGE-ML et aboutissant ensuite au stockage de données dans une base de données relationnelle (53).

Récemment, la nanotechnologie a été largement mise en œuvre dans divers domaines, tels que les applications industrielles, pharmaceutiques et gouvernementales, pour améliorer les progrès scientifiques modernes. En raison des caractéristiques physiques et chimiques uniques des nanoparticules, ces matériaux ont la capacité d’améliorer les dispositifs sensoriels, les additifs de propulsion, les techniques de remodelage des tissus et les mécanismes de ciblage des médicaments. En outre, la nanotechnologie a été utilisée pour améliorer la compétence en matière de microréseaux (54) et pour aider au développement de nanoréseaux protéiques (55). En laboratoire, les scientifiques commencent maintenant à étudier l’impact positif/ négatif potentiel des nanoparticules sur l’induction/l’inhibition des gènes au sein des cellules en utilisant la technique des microréseaux (56). Enfin, la combinaison de la nanotechnologie et de la technologie des microréseaux a même fait progresser les connaissances actuelles sur les gènes régulés de manière différentielle au cours des processus pathologiques (57,58).

Ensemble, ces outils peuvent contribuer à la compréhension de nouvelles fonctions géniques dans divers génomes et de la façon dont elles sont corrélées avec la pathogenèse de la maladie chez l’homme. Le développement et l’application de la technologie des puces à adn cDNA ont permis de nombreux progrès dans la découverte de médicaments, de diagnostics de recherche et de thérapies géniques potentielles destinées au traitement de diverses maladies. Cette technologie fondamentale aide les chercheurs à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans des processus biologiques multiples et divers.

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