L’isolement et l’expansion à long terme des cellules primaires, en particulier des populations souches / progénitrices, sont des techniques de base fondamentales et importantes dans divers domaines biologiques, y compris la biologie du développement et la biologie des cellules souches, et la science médicale. Les cellules des tissus épithéliaux stratifiés et colonnaires sont hautement régénératrices et responsables de manière disproportionnée de nombreux cancers humains; cependant, le clonage de cellules souches adultes est limité par des difficultés à maintenir ces cellules dans un état immature. Ces dernières années, les innovations techniques ont permis des progrès rapides et spectaculaires en biologie des cellules souches, tels que l’utilisation de petites molécules et de facteurs de croissance pour imiter les environnements de niche tissulaire et faciliter la « culture organoïde ».
En 1975, Rheinwald et Green ont établi le premier exemple réussi de culture de cellules souches adultes humaines utilisant des kératinocytes humains. Plus précisément, ils ont maintenu les kératinocytes humains à long terme en combinaison avec une lignée cellulaire de fibroblastes de souris irradiée sublétalement, 3T3-J2. Bien qu’ils n’aient pas utilisé le terme « cellules souches » pour désigner les kératinocytes clonés cultivés sur des cellules 3T3, Green et ses collègues ont trouvé des colonies avec la capacité remarquable de se diviser et de former de nouvelles colonies après le passage, qu’ils ont appelées « Holoclones ». Ces holoclones sont constitués de petites cellules immatures qui ont toutes présenté une coloration nucléaire intense avec p63, un régulateur maître de la tige, dans les cellules épithéliales stratifiées. Dans l’épithélium stratifié, y compris la peau, la bronchie pulmonaire, la glande mammaire et l’urothélium de la vessie, la population de cellules souches était principalement localisée dans la couche basale et les cellules immatures étaient colorées avec du p63, conformément aux études in vitro. De manière significative, des kératinocytes humains isolés et expansés de peau autologue ont été greffés avec succès pour brûler des patients et régénérer un épiderme permanent ressemblant à celui résultant de greffes de peau d’épaisseur fendue. Notamment, la même procédure a été appliquée pour isoler et étendre les cellules épithéliales cornéennes humaines en vue d’une transplantation. Bien que cette technologie soit limitée aux cellules souches de l’épiderme et de la cornée à cette époque, Green et ses collègues ont créé les bases du clonage de cellules souches adultes humaines dans les domaines de la biologie fondamentale et de la médecine régénérative.
Dans cet article de revue, nous donnons un aperçu des progrès récents de la recherche et de l’accumulation de preuves d’un système de culture cellulaire qui a conduit à des percées techniques dans les technologies des cellules épithéliales. De nouvelles stratégies de culture pour les cellules épithéliales stratifiées et les cellules épithéliales colonnaires ont permis de récapituler le développement épithélial humain et peuvent être utilisées pour générer un modèle de maladie humaine in vitro. Nous discutons également du potentiel et des applications possibles des technologies de culture de cellules épithéliales normales pour la médecine régénérative et mettons en évidence un système de culture de cellules cancéreuses qui reproduit les phénotypes individuels des patients.
Culture de cellules épithéliales stratifiées
Dans les tissus épithéliaux stratifiés, y compris l’épithélium glandulaire et pseudostratifié, les cellules p63+, localisées sur la membrane basale, peuvent s’auto-renouveler pour maintenir les populations souches /progénitrices et donner naissance à une descendance qui forme des tissus fonctionnels. Comme mentionné ci-dessus, le clonage et l’expansion de cellules souches épithéliales, telles que les kératinocytes cutanés et les cellules épithéliales cornéennes, ont été bien établis dans des systèmes de co-culture avec des fibroblastes 3T3-J2 de souris irradiées. Cependant, ce protocole standard a été largement limité à la culture à long terme de kératinocytes et de cellules cornéennes. Néanmoins, des cellules souches clonées provenant d’épithéliums thymiques ont été rapportées, tout comme l’isolement de cellules souches épithéliales thymiques provenant de diverses espèces, y compris de cellules humaines, cultivées avec un système d’alimentation 3T3. De plus, Frey et ses collègues ont récemment appliqué la méthode d’alimentation 3T3 pour isoler les cellules souches urothéliales qui exprimaient sonic hedgehog et résidaient dans la couche basale de l’urothélium de la vessie. Ces cellules souches urothéliales provenant de tissus humains et porcins isolés ont été cultivées de manière stable sur une couche d’alimentation en 3T3 et ont pu donner naissance à plusieurs lignées cellulaires, y compris des cellules basales p63+ et des cellules urothéliales Uroplakines 2+ et 3+, après transplantation de capsules rénales chez des souris nues. En 2011, Pooja et al. exploité le système de culture 3T3 pour isoler trois types de cellules souches épithéliales des voies respiratoires humaines, i.e., les cellules souches des voies respiratoires nasales, trachéales et distales, et ont constaté que ces cellules souches épithéliales des voies respiratoires présentaient des phénotypes cellulaires distincts après différenciation in vitro, bien que les clones de cellules souches immatures semblaient être morphologiquement indiscernables (Fig. 1) . Dans une étude de suivi, la transplantation de cellules souches épithéliales des voies respiratoires trachéales et distales de souris a démontré que les cellules souches des voies respiratoires distales étaient facilement incorporées dans le tissu pulmonaire endommagé par la grippe H1N1 et différenciées en plusieurs types de cellules épithéliales, c.-à-d., les bronchioles et les alvéoles, alors que les cellules souches trachéales transplantées n’étaient localisées que dans les principales voies respiratoires. Des cellules souches clonogènes ont également été isolées à partir d’échantillons de biopsie endoscopique de l’œsophage humain, et ces cellules ont pu former des structures épithéliales squameuses stratifiées bien différenciées dans un système de culture d’interface air liquide (ALI).
Schéma du processus de culture cellulaire de cellules souches épithéliales stratifiées et colonnaires humaines sur une couche d’alimentation de souris 3T3. Pour les cellules souches épithéliales stratifiées, elles sont isolées à partir d’une biopsie ou des échantillons chirurgicaux sont plaqués sur une couche 3T3 pour une culture à long terme. Pour les cellules souches épithéliales colonnaires, elles sont plaquées sur une couche 3T3 avec des facteurs définis qui sont essentiels à la croissance et au maintien des cellules souches. Les colonies morphologiquement immatures (colonies emballées avec de petites cellules) de cellules souches épithéliales sont ramassées mécaniquement pour une expansion plus homogène. Dans la culture ALI, les cellules subissent une différenciation en types de cellules matures dans un puits trans
Schlegel et ses collègues ont rapporté qu’un inhibiteur de la protéine kinase associée à la Rho (ROCK) en combinaison avec des cellules nourricières 3T3 augmentait de manière significative la capacité proliférative des cellules souches épithéliales, y compris les kératinocytes humains, les cellules de la prostate et les cellules des glandes mammaires, et ils ont appelé ce phénomène « reprogrammation conditionnelle ». La capacité de générer efficacement des cultures de cellules souches épithéliales à partir de patients fournit des informations essentielles et précieuses sur les diagnostics et les thérapies cellulaires. Plus récemment, Rajagopal et ses collègues ont montré que la voie de signalisation TGFß / BMP / SMAD est importante dans divers tissus épithéliaux, y compris le tissu cutané et mammaire dérivé de l’ectoderme, le tissu de l’œsophage et de la prostate dérivé de l’endoderme et l’épididyme dérivé du mésoderme. Ils ont découvert que la double inhibition de la signalisation SMAD (le signal BMP était bloqué par DMH-1 et le signal TGFß était inhibé par A-83-01) facilitait la propagation stable des populations de cellules basales épithéliales humaines et de souris. Étonnamment, la double inhibition TGFß / BMP a permis l’expansion robuste des cellules souches épithéliales sans avoir besoin de cellules nourricières 3T3 de souris.
Collectivement, ces progrès techniques, en combinaison avec de petites molécules et des cellules nourricières, peuvent être utilisés pour étendre de manière continue et efficace les populations épithéliales stratifiées de souches / progéniteurs in vitro. Une autre percée dans la culture épithéliale stratifiée, la culture organoïde, a été utilisée pour étendre les progéniteurs de la prostate humaine basale et luminale. Ces progéniteurs luminaux humains étaient multipotents et formaient des structures semblables à la prostate in vitro. Cependant, la génération de structures tridimensionnelles constituées d’épithéliums stratifiés ou pseudostratifiés pour récapituler une architecture in vivo authentique reste difficile, bien que de nombreux chercheurs aient rapporté des cultures sphéroïdes et organoïdes. Ce problème peut être résolu en établissant une méthode pour faciliter l’auto-organisation, telle qu’elle est réalisée dans des tissus dérivés de cellules souches pluripotentes.
Culture de cellules épithéliales colonnaires
Bien que les cellules souches intestinales possèdent la capacité remarquable de proliférer à un taux de renouvellement élevé pour maintenir les épithéliums intestinaux, et que les hépatocytes soient hautement régénérateurs en réponse aux dommages, la capacité de cloner des populations de cellules souches à partir de cellules épithéliales colonnaires est sévèrement limitée, probablement en raison d’un manque de signaux de niche tissulaire in vitro. Au cours de la dernière décennie, Clevers et ses collègues ont découvert le LGR5 (récepteur couplé à la protéine G contenant des répétitions riches en leucine 5), un marqueur de cellules souches intestinales, dans un modèle de souris sophistiqué (souris Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 croisées avec le reporter Rosa26 LacZ activé par le Cre) et ont établi une méthode de culture d’organoïdes intestinaux de souris qui consiste en des structures ressemblant à des villosités et des zones ressemblant à des cryptes avec plusieurs types de cellules intestinales. En combinaison avec des facteurs de croissance et des cocktails à petites molécules, une fraction isolée de cellules souches LGR5+ a été suspendue dans Matrigel et cultivée à long terme. En modifiant la condition de culture avec l’utilisation de nicotinamide, un inhibiteur des récepteurs p38 et TGFß, des cellules épithéliales humaines isolées de l’intestin grêle et du côlon ont pu se développer à l’infini à long terme in vitro. Cette technique est applicable à la culture d’autres types de cellules, telles que les cellules du canal pancréatique et les hépatocytes, et a facilité des progrès révolutionnaires dans la culture de cellules épithéliales colonnaires.La culture organoïde
utilise une plate-forme de culture 3D basée sur un Matrigel et peut être largement utilisée pour cultiver de manière stable divers types de cellules épithéliales adultes, y compris des cellules épithéliales stratifiées, avec des populations de cellules souches / progénitrices. Cependant, la capacité de propager rapidement et efficacement une fraction de cellules souches uniformes in vitro est également utile et importante pour l’étude détaillée de l’auto-renouvellement et de la spécification du devenir dans les cellules souches tissulaires et les applications futures possibles de la transplantation de cellules pour la médecine régénérative. Xian et ses collègues ont récemment développé un nouveau système de culture pour l’expansion homogène des cellules souches intestinales fœtales humaines, y compris les cellules de l’intestin grêle et du côlon. Ce système utilisait une couche d’alimentation de souris 3T3 en combinaison avec des facteurs de croissance et des inhibiteurs de la voie du signal pour développer de manière robuste les cellules souches épithéliales colonnaires humaines (Fig. 1) . De plus, plus de 50% des cellules souches intestinales cultivées sur des fibroblastes 3T3 ont pu former des colonies. Dans l’intestin des mammifères, des facteurs de niche définis, tels que les signaux Wnt et Notch, sont essentiels pour régir la tige des cellules souches intestinales à la base de la crypte. De plus, les cellules Paneth, qui sont également situées à la base de la crypte, proviennent de cellules souches et agissent comme la niche des cellules souches en fournissant des facteurs essentiels de manière paracrine. Étant donné que les cultures organoïdes sont constituées de cellules souches et de divers dérivés, tels que les cellules de Paneth, les facteurs de niche sont fournis de manière autonome. En revanche, comme une population pure de cellules souches intestinales est cultivée sur une couche d’alimentation 3T3, les cellules ne peuvent pas sécréter de facteurs de niche. Par conséquent, des facteurs extrinsèques ressemblant à des facteurs de niche doivent être complétés. En plus du protocole de maintien des cellules souches, un protocole de différenciation a été établi dans un modèle de culture ALI pour donner naissance à au moins quatre types de cellules intestinales principales, à savoir les cellules Paneth, les cellules entéro-endocrines, les cellules caliciformes et les entérocytes (cellules absorbantes intestinales). La formation de structures ressemblant à des villosités intestinales a été observée selon les types de tissus d’origine, tels que les tissus de l’intestin grêle et du côlon (Fig. 1). Dans une approche de culture ALI différente, Kuo et ses collègues ont cultivé de manière robuste de petits morceaux d’intestin néonatal de souris avec un élément stromal à long terme.
La même stratégie a également été appliquée au clonage de cellules souches gastriques humaines obtenues par biopsie endoscopique. Plus précisément, les cellules gastriques clonogènes ont été développées de manière stable sur une couche d’alimentation 3T3 en combinaison avec des facteurs de croissance et de petites molécules et différenciées en lignées épithéliales gastriques généralement présentes dans l’estomac, telles que les cellules principales exprimant le pepsinogène. En plus des cellules souches d’organes digestifs clonées, les cellules progénitrices d’oviductes du tube utérin distal ont également pu se propager à l’infini sur une couche d’alimentation 3T3 en présence de facteurs de niche. L’oviducte distal, l’épithélium de fimbria, est une simple couche d’épithélium colonnaire composée des deux types de cellules suivants: les cellules ciliées, qui améliorent le transport des gamètes, et les cellules sécrétrices, qui sécrètent du mucus. En utilisant une légère modification du protocole de différenciation des cellules souches intestinales, les cellules souches oviductales cultivées à long terme en culture ALI ont donné naissance à une architecture 3D, contenant à la fois des cellules ciliées et des cellules sécrétrices, qui rappelait la structure de l’épithélium in vivo. La capacité de produire des lignées épithéliales avec des types cellulaires appropriés à partir d’une population de cellules souches pourrait être un outil utile pour étudier le développement épithélial physiologique et l’homéostasie et développer des modèles de maladies aiguës et chroniques in vitro.
Culture de cellules cancéreuses
Depuis que la première lignée cellulaire cancéreuse, la lignée cellulaire HeLa, a été établie à partir d’un patient atteint d’un cancer du col de l’utérus en 1951, des lignées cellulaires cancéreuses établies à partir d’une grande variété de types de cancer ont été largement utilisées pour étudier la pathobiologie du cancer et ont permis de générer des modèles de xénogreffe in vivo et de tester des médicaments anticancéreux in vitro et in vivo. Bien que des progrès considérables aient été réalisés en biologie du cancer à l’aide de lignées de cellules cancéreuses, les résultats obtenus à l’aide de ces cellules peuvent ne pas refléter suffisamment la complexité de la maladie comme prévu initialement, car le cancer présente une hétérogénéité interpatiante et intratumorale, comme l’ont révélé les progrès récents du séquençage de nouvelle génération. Pour refléter plus précisément les phénotypes du cancer, y compris l’état de mutation génétique et la pathologie du patient, Welm et ses collègues ont développé des modèles de xénogreffe dérivée du patient (PDX) du cancer du sein chez des souris d’immunodéficience combinée sévère diabétique non obèse (NOD-SCID) qui conservaient les caractéristiques essentielles des tumeurs d’origine et présentaient une capacité métastatique à des sites spécifiques. En plus du modèle du cancer du sein, la mise en place de divers types de tumeurs solides a démontré la faisabilité des modèles PDX, qui devraient accélérer les tests précliniques de nouvelles thérapies anticancéreuses et aider à réaliser l’objectif de la « médecine personnalisée ».
Les méthodes de culture de cellules souches adultes, telles que les systèmes organoïdes et d’alimentation, sont également applicables à différentes approches utilisant des cellules cancéreuses dérivées du patient. Plus précisément, Clevers et ses collègues ont rapporté que la culture d’organoïdes peut être utilisée pour modéliser le cancer du pancréas, de la prostate et du colorectal et ont montré que les caractères cancéreux originaux, y compris l’hétérogénéité génétique et la sensibilité aux médicaments, peuvent être récapitulés. Par conséquent, ils ont appelé ce système une « biobanque organoïde vivante ». Ces technologies pourraient également être utilisées pour isoler une population de cellules souches d’une lésion précancéreuse, telle que l’œsophage de Barrett, un précurseur de l’adénocarcinome œsophagien humain. Des cellules souches de l’œsophage de Barrett isolées et élargies ont été transformées en introduisant un grand antigène T SV40, hTERT et c-myc et xénogreffées dans des souris NSG immunodéprimées (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). Comme prévu, les cellules souches de l’œsophage de Barrett se sont transformées en tumeurs de type adénocarcinome œsophagien chez la souris. Une approche similaire a démontré que les cellules souches oviductales humaines étaient la cellule d’origine du cancer épithélial ovarien séreux de haut grade. Cette découverte corrobore une pathologie humaine récente et les preuves du modèle de souris transgénique, qui indiquent que l’épithélium oviductal distal est le tissu d’origine de ce cancer. En combinaison avec le système CRISPR/ Cas9, les cellules souches normales du côlon ont été transformées séquentiellement en introduisant les mutations motrices fréquemment détectées dans le cancer colorectal. Les cellules résultantes ont été autorisées à former des xénogreffes dans la capsule rénale et ont présenté une transformation progressive en phénotypes de type adénocarcinome caractérisés par des propriétés invasives et métastatiques. Dans l’ensemble, la capacité d’isoler et de cultiver des cellules à partir de tissus épithéliaux normaux adaptés aux tumeurs et aux patients facilite la production d’une plate-forme qui complète non seulement le travail animal classique in vivo dans le domaine de la biologie du cancer, mais facilite également les approches génétiques et génomiques spécifiques aux patients in vitro.
Modélisation de la maladie inflammatoire avec des cellules souches adultes
La modélisation de la maladie humaine est entravée par l’accessibilité limitée des tissus malades humains. Néanmoins, les progrès de la culture de cellules souches adultes nous ont permis de reproduire des phénotypes de maladies in vitro en dilatant des cellules souches et en dérivant des types de cellules matures à partir de petits échantillons de biopsie humaine. Étant donné que les méthodes de culture 3D, telles que l’ALI et la culture organoïde, fournissent des structures composées de plusieurs types cellulaires et ressemblent à l’architecture épithéliale observée in vivo, elles devraient être adaptées à l’étude des maladies inflammatoires, y compris les maladies infectieuses et héréditaires. Plus précisément, la reproduction du phénotype de la maladie est simple lorsque l’agent pathogène (ou la cause principale) et le type cellulaire ciblé sont connus.
La colite pseudomembraneuse (CMP) est causée par une augmentation disproportionnée de la population de Clostridium difficile (C. difficile) après un traitement antibiotique. C. difficile est une bactérie à Gram positif, formant des spores, et produit les toxines de haut poids moléculaire TcdA et TcdB, qui induisent la sécrétion de liquide, l’inflammation et les lésions des tissus du côlon. Les cellules épithéliales du côlon différenciées des cellules souches du côlon clonogènes en culture ALI ont été mises au défi avec ces toxines, ce qui a causé des dommages épithéliaux dévastateurs en fonction du temps et de la dose. Ce résultat indique que le modèle de culture 3D peut être utilisé pour représenter la pathologie du C. difficile. De même, l’effet de l’infection à Helicobacter pylori (H. pylori), qui provoque une gastrite chronique, des ulcères gastriques et un cancer, a été étudié en micro-injectant H. pylori dans des cultures organoïdes. Les cultures d’organoïdes infectées par des bactéries présentaient une inflammation accrue, telle que l’activation de NF-kB et l’induction d’IL8, et l’expression d’IL8 était significativement plus élevée dans les cultures d’organoïdes de type glande que dans les cultures d’organoïdes de type pit.
Des cellules souches adultes ont également été utilisées pour modéliser des maladies héréditaires. Beekman et ses collègues ont rapporté une culture organoïde intestinale dérivée de patients atteints de fibrose kystique (FK). La mucoviscidose est causée par des mutations du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR), qui est normalement exprimé dans les cellules épithéliales de nombreux organes, tels que les tissus pulmonaires et digestifs. Bien que les cultures normales d’organoïdes intestinaux aient montré un gonflement robuste en réponse à la forskoline, la réponse au gonflement n’a pas été observée dans les cultures d’organoïdes FC. De plus, lorsque le locus CFTR muté a été corrigé à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 chez des organoïdes intestinaux de patients atteints de mucoviscidose, il a été démontré que les gènes corrigés fonctionnaient. Par conséquent, la différenciation in vitro de cellules souches adultes, ressemblant à des phénotypes in vivo avec plusieurs types de cellules en combinaison avec des technologies d’édition de gènes, fournit des moyens puissants pour traiter les maladies humaines et peut fournir un aperçu direct de la pathologie humaine.
Application de cellules souches épithéliales pour la médecine régénérative
Malgré des stratégies prometteuses qui utilisent des cellules souches embryonnaires humaines (ES) et des cellules souches pluripotentes induites (iPS) pour des applications en médecine régénérative, peu d’essais cliniques de ces stratégies sont en cours, ce qui est en partie dû aux difficultés de spécification de la lignée et à la possibilité de tumorigénèse. Étant donné que les cellules souches adultes sont essentiellement affectées à des types de tissus spécifiques, la production de types de cellules prévus est relativement facile et le risque potentiel de tumorigénèse est faible. Ainsi, les approches thérapeutiques visent à utiliser les cellules souches adultes comme source cellulaire pour la transplantation. Bien que Green et ses collègues aient établi la méthode de culture des kératinocytes humains en 1975 et que les cellules cultivées puissent être transplantées chez des patients souffrant de brûlures ou de blessures chimiques, la culture à long terme d’autres types de cellules souches adultes était soumise à des obstacles techniques importants. Comme décrit ci-dessus, les progrès techniques récents ont surmonté cette limitation pour divers types de cellules épithéliales. Par conséquent, la capacité d’élargir rapidement et efficacement les populations de cellules souches est précieuse pour leur utilisation en médecine régénérative.
Par exemple, des cellules souches coliques Lgr5+ de souris ont été dilatées en culture organoïde et transplantées dans le côlon endommagé de la souris, et des cellules greffées capables de s’auto-renouveler et de se différencier ont été détectées même après 25 semaines. Dans une approche différente, Zhang K et ses collègues ont exploité des cellules souches adultes modifiées pour une étude de transplantation. Tout d’abord, ils ont réussi à cultiver des cellules épithéliales cornéennes dans une boîte sans cellules nourricières, puis ont découvert que Pax6 est un facteur de transcription clé qui différencie les cellules souches cornéennes (CSCS) des kératinocytes cutanés. Étonnamment, la surexpression de Pax6 dans les kératinocytes a induit des cellules limbales ressemblant à des cellules souches, et ces cellules ont pu être transplantées dans les cornées blessées des lapins. Étant donné que les kératinocytes sont plus facilement accessibles que les CSC, cette méthode peut être applicable au traitement des maladies oculaires humaines. Plus récemment, Liu et coll. a rapporté une approche attrayante pour la réparation et la régénération des tissus utilisant des cellules souches endogènes. Dans leur étude, les cellules souches épithéliales du cristallin (LEC) qui ont exprimé Pax6 et Bmi1 ont été caractérisées et ont montré un potentiel de régénération in vivo. Une méthode chirurgicale d’ablation de la cataracte qui préserve les LEC endogènes a été utilisée, et ces LEC ont contribué à la régénération spontanée des lentilles ayant une fonction visuelle chez le lapin, le macaque et le nourrisson humain. Cette méthode pourrait être une percée thérapeutique pour le traitement de la cataracte et potentiellement remplacer l’implantation artificielle de lentilles intraoculaires.
En raison des taux de renouvellement élevés de nombreuses cellules épithéliales, la transplantation de populations de cellules souches est essentielle au maintien à long terme des tissus. Théoriquement, une seule cellule souche peut reconstituer des tissus entiers, et plusieurs groupes de recherche ont démontré empiriquement cette notion. Malgré le potentiel des cellules souches pluripotentes (CSP), qui peuvent donner naissance à tous les types de cellules, les cellules souches tissulaires dérivées de la CSP ne peuvent probablement pas être maintenues à l’état immature in vitro. Par conséquent, l’utilisation de cellules souches adultes pour la médecine régénérative présente un avantage significatif.